厌氧菌的分离培养与初步鉴别方法！

厌氧菌（anaerobicbacteria）是一类在无氧条件下比在有氧环境中生长好的细菌，而不能在空气（18%氧气）和（或）10％二氧化碳浓度下的固体培养基表面生长的细菌。这类细菌缺乏完整的代谢酶体系，其能量代谢以无氧发酵的方式进行。厌氧菌是人体正常菌群的组成部分，广泛存在于人体皮肤和腔道的深部黏膜表面，在组织缺血、坏死，或者需氧菌感染的情况下，导致局部组织的氧浓度降低，才发生厌氧菌感染。

一、厌氧菌标本的送检方法与处理

标本送到实验室后，应在20～30min内处理完毕，最迟不超过2h，以防止标本中兼性厌氧菌过度繁殖而抑制厌氧菌的生长。如不能及时接种，可将标本置室温保存（一般认为，冷藏对某些厌氧菌有害，而且在低温时氧的溶解度较高）。 

1、针筒运送：一般用无菌针筒抽取标本后，排尽空气，针头插入无菌橡皮塞，以隔绝空气，立即送检。这种方法多用于液体标本的运送，如血液、脓液、胸腹水、关节液等医.学教育网搜集整理。 

2、无菌小瓶运送：一般采用无菌的青霉素小瓶，瓶内加一定量的培养基和少量氧化还原指示剂，用橡皮盖加铝盖固定密封，排除瓶内空气，充以C02气体。同时先观察瓶内氧化还原指示剂的颜色，以判断瓶内是否为无氧环境，如合格将用将液体标本注入瓶中即可。 

3、棉拭子运送：一般不采用棉拭子运送，如果使用该方法，一定使用特制运送培养基，确保无氧环境，确保不被污染，确保快速送检。 

4、厌氧罐或厌氧袋运送：将厌氧罐或厌氧袋内装入可有效消耗氧气的物质，确保无氧环境。该方法一般用于运送较大的组织块或床边接种的培养皿等。

二、厌氧菌的分离培养

厌氧菌的分离培养主要分初代培养和次代培养两个阶段，其中初代培养相对比较困难，关键的问题就是厌氧环境和培养基的选择。初代培养的一般原则是： 

1）先将标本涂片染色直接镜检，指导培养基的选择。 

2）尽量选用在厌氧菌中覆盖面宽的非选择性培养基。 

3）多选1～2种覆盖面不同的选择性培养基。 

4）尽量保证培养基新鲜。 

5）要考虑到微需氧菌存在的可能。

1、选用适当的培养基接种：应接种固体和液体两种培养基； 

（1）培养基的使用，应注意下列各点： 

1）尽量使用新鲜培养基，2～4h内用完； 

2）应使用预还原培养基，预还原24～48h更好； 

3）可采用预还原灭菌法制作的培养基（用前于培养基中加入还原剂，如L-半胱氨酸、硫乙醇酸钠、维生素C及葡萄糖等，尽可能使预还原剂处于还原状态）； 

4）液体培养基应煮沸10min，以驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种； 

5）培养厌氧菌的培养基均应营养丰富，并加有还原剂与生长刺激因子（血清、维生素K、氯化血红素、聚山梨酯-80等）。

（2）培养基的选择：初次培养一般都使用选择培养基和非选择培养基。 

1）非选择培养基：本培养基使分离的厌氧菌不被抑制，几乎能培养出所有的厌氧菌。常使用心脑浸液琼脂（BHI）、布氏琼脂（BR）、胰豆胨肝粉琼脂（GAM）、胰胨酵母琼脂（EG）、CDC厌氧血琼脂等。 

2）选择培养基：为有目的选择常见厌氧菌株，以便尽快确定厌氧的种类。

2、每份标本至少接种3个血平板，分别置于有氧，无氧及5%～10à2环境中培养，以便正确地培养出病原菌，从而判断其为需氧菌、兼性厌氧菌、微需氧菌或厌氧菌中的哪一类。

3、厌氧培养法

（1）厌氧罐培养法。

（2）气袋法。

（3）气体喷射法：又称转管法。

（4）厌氧手套箱培养法：是迄今厌氧菌培养的仪器之一。

（5）其他培养法：平板焦性没食子酸法；生物耗氧法；高层琼脂培养法。

4、厌氧状态的指示：美蓝和刃天青。无氧时均呈白色，有氧时美蓝呈蓝色，刃天青呈粉红色。

5、分离培养厌氧菌失败的原因：

①培养前未直接涂片和染色镜检；

②标本在空气中放置太久或接种的操作时间过长；

③未用新鲜配制的培养基；

④未用选择培养基；

⑤培养基未加必要的补充物质；

⑥初代培养应用了硫乙醇酸钠作为厌氧菌培养基；

⑦无合适的厌氧罐或厌氧装置漏气；

⑧催化剂失活；

⑨培养时间不足；

⑩厌氧菌的鉴定材料有问题。

三、厌氧菌直接镜检初步鉴别

coccus，球菌；b：bacillus，杆菌。

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