分光光度计的基本工作原理是基于物质对光（对光的波长）的吸收具有选择性，不同的物质都有各自的吸收光带，所以，当光色散后的光谱通过某一溶液时，其中某些波长的光线就会被溶液吸收。在一定的波长下，溶液中物质的浓度与光能量减弱的程度有一定的比例关系，即符合比尔定律。　　
　　分光光度计的构造
　　
　　分光光度计允许的测定波长范围在360～800nm，其构造比较简单，测定的灵敏度和精密度较高。因此，应用比较广泛。721型分光光度计的仪器构造见下图。
　　
　　从光源灯发出的连续辐射光线，射到聚光透镜上，会聚后，再经过平面镜转角90°，反射至入射狭缝。由此入射到单色器内，狭缝正好位于球面准直物镜的焦面上，当入射光线经过准直物镜反射后，就以一束平行光射向棱镜。光线进入棱镜后，进行色散。色散后回来的光线，再经过准直镜反射，就会聚在出光狭缝上，再通过聚光镜后进入比色皿，光线一部分被吸收，透过的光进入光电管，产生相应的光电流，经放大后在微安表上读出。
　　
　　分光光度计的使用方法
　　
　　①首先接通电源，打开电源开关1，指示灯亮，打开比色皿暗箱盖8，预热20分钟。
　　
　　②波长选择旋钮6，选择所需的单色光波长，用灵敏度旋钮2选择所需的灵敏档。
　　
　　③放入比色皿，旋转零位旋钮5调零，将比色皿暗箱盖合上，推进比色皿拉杆3，使参比比色皿处于空白校正位置，使光电管见光，旋转透光率调节旋钮4，使微安表9指针准确处于。按上述方法连续几次调整零位和位，即可进行测定工作。
　　
　　分光光度计使用和维护中应注意事项：
　　
　　①连续使用仪器的时间不应超过2小时，是间歇0.5小时后，再继续使用。
　　
　　②比色皿每次使用完毕后，要用去离子水洗净并倒置晾干后，存放在比色皿盒内。在日常使用中应注意保护比色皿的透光面，使其不受损坏或产生划痕，以免影响透光率。
　　
　　③仪器不能受潮。在日常使用中，应经常注意单色器上的防潮硅胶（在仪器的底部）是否变色，如硅胶的颜色已变红，应立即取出烘干或更换。
　　
　　④在托运或移动仪器时，应注意小心轻放。