1、介绍

       蛋白质化学家一直希望在中红外区（mid-IR）跟踪蛋白质的折叠动力学，以便更好地了解蛋白质的折叠过程，并获得折叠过程中二级结构变化的信息。传统上，动力学停流装置是耦合到傅里叶变换红外（FTIR）光谱仪。尽管FT-IR技术的进步和步进扫描采集的使用，这种快速动力学装置的主要限制通常是FT-IR光谱仪的时间分辨率。最快的采集速度通常在30-50 ms范围内（甚至更长），因此它与Bio-Logic SFM的几毫秒死时间（使用FTIR池）不匹配。实际上，这些光谱仪是为稳态研究应用而设计的，干涉仪的使用限制了数据采集的速度。因此，用这种技术不可能观察到短于100-200ms的快速动力学过程。

       一些自制的红外探测系统已在实验室中开发1，以达到这种采集速度并获得毫秒分辨率，但到目前为止，还没有一个商业化。

图1 SFM-4000与IRis-F1（IRsweep）连接。

性能参数：

·5ms死时间

·75-100 μl每次注射样品体积

·脐带容积200μl

·单、双、三混

· 100 μm至500μm光程

·红外光谱4μs采集时间

·0.3cm-1分辨率下1000光谱/秒连续反应监测

·10-3 AU单次注射的噪声水平

       另一个限制是分光计的信噪比，因为它与采集速度直接相关。具有更快采集速度的商用FT-IR光谱仪通常需要对多次停流曲线进行平均，以提高信噪比，这在红外区域内需要处理珍贵或浓缩样品时会出现问题。

       为了克服傅立叶变换红外光谱仪的采集速度和灵敏度问题，IRsweep2公司研制了一种基于双梳光谱的新型红外光谱仪。IRsweep公司的IRis-F1光谱仪是一种双梳光谱仪，专为快速动力学测量而设计。本应用说明的目的是说明如何将Bio-Logic SFM与IRsweep IRis-F1连接起来，以毫秒时间标度跟踪反应，并观察之前没有见过的中红外反应现象。

2、什么是双梳光谱？

       双梳状光谱仪的原理与传统的傅里叶变换或色散光谱仪*不同。两个紧密匹配的激光源发射的宽带红外光束（频率梳）通过样品后叠加在单个探测器元件上。检测到的光的波长是根据在探测器上观察到的射频信号的频率来解析的。由于不需要运动部件，一次实验只需4微秒就能记录到完整的红外光谱。因此，如本应用说明所示，通过停流技术研究的毫秒反应动力学可以很容易地遵循在优越信噪比下的红外光谱特征。基于高功率激光源，双梳光谱仪还具有高亮度，允许在强吸收溶剂中进行高光谱和时间分辨率的测量。

3、实验装置

       本应用笔记中使用了SFM-4000和IRis-F1光谱仪（见图1）。SFM-4000有3个混合器和4个注射器，由独立的步进电机驱动，使用户可以*控制体积、注射速度和混合比。SFM的FTIR附件与Iris-F1样品室*兼容。

       流通池使用CaF2窗口，用户可以通过改变窗户之间的间隔物在100μm至500μm自由改变光程。在本应用笔记中，安装的是100μm光程，对应是15μl的死体积（从最后一个混合器到流通池中心）。因此，使用3ml/s的流速，对应的死时间为5ms。最后一个混合器直接集成到FT-IR附件中，以最小化死体积。

       SFM-4000主体通过脐带连接器连接到FT-IR流动池，脐带将来自混合器2出口和注射器4的溶液输送到最后一个混合器，进入最终混合阶段。通过硬截止阀与停止电机的同步来确保液流的瞬时停止。停止流量推送和IRis-F1之间的同步是使用5V TTL触发器实现的。

4、β-乳球蛋白结构改变

       β-乳球蛋白的二级结构在用三氟乙醇作为变性剂中从β-折叠到α-螺旋的快速转变由Gerwert等人描述4。这种快速反应用于演示SFM-4000和IRis-F1耦合的性能。

       二级结构的转变是通过1:1的比例混合浓度25mg/ml的在10%三氟乙醇/20 mM DCl的重水中的β- 乳球蛋白，与60%三氟乙醇/20 mM DCl的重水中（见图2），导致三氟乙醇的浓度变化从10%V到35%V。

图2用于β- 乳球蛋白反应的混合序列

       用氘化水和盐酸来避免H2O在1650cm-1处的强背景吸收。实验采用每种溶液100μl和3 ml/s的总速度注入，导致5 ms的死时间。

       以每次4μs连续采集130毫秒得到光谱。对应于反应初始状态的预触发光谱被用作吸收光谱的背景。在后处理中，光谱在1ms内进行共平均，光谱以3cm-1进行平均。

图3 反应10ms获得的红外光谱。可见的连续偏移。

       图3显示了10 ms测量的红外光谱的演变，1635 cm-1和1660 cm-1处的谱带证实了快速中间体的存在，如Gerwert等人所观察到的。

图4 β-乳球蛋白结构改变：DA时间痕迹， 4次停流注射的平均

       图4显示了通过减去1623 cm-1处的吸光度校正基线漂移后4次停流实验的平均值。反应在约100ms内完成，但在10ms以下的早期可以获得非常明确的信号。

5、结论

       使用标准FT-IR和脐带连接器附件，Bio-Logic SFM可以很容易地耦合到Iris-F1双梳光谱仪。使得小于10ms的生化反应动力学可以在中红外区进行研究，而传统的红外光谱实验是受限的。

       利用IRis-F1，在10-3 AU（吸光度单位）下以1ms的时间分辨率获得单次停流注射的吸光度谱。共同平均多次注射或降低时间分辨率，灵敏度可以进一步提高。

       所述实验仅使用的SFM-4000两个注射器，但如果用户希望编程自动浓度研究或双重混合实验，则可以使用额外的两个注射器，在这种情况下，使用一条脐带线作为延迟线来老化第一次混合。SFM-2000和SFM-3000也可以与IRis-F1光谱仪耦合。

参考文献：

1) J. Tang, F. Gai, A Millisecond Infrared Stopped-Flow Apparatus. Applied Spectroscopy. 

2) A. Hugi, G. Villares, S. Blaser, H.C. Liu, J. Faist, Mid-infrared frequency comb based on a quantum cascade laser. Nature 

3)  Kauffmann, E., Gerwert, K. et al.