FLASH色谱纯化实验小讲堂:FLASH C18色
谱柱使用注意事项
色谱分类中,固定相极性强于流动相的分离模式被称为正相分离模式,固定相极性弱于流动相的分离模式称为反相分离模式。作为反相色谱固定相中的一种,C18是一种基质(常用基质是硅胶)上键合十八烷基基团的色谱固定相,与昂贵动辄几万的高压C18柱相比,FLASH C18色谱柱有价格优势。尽管C18的价格在FLASH色谱柱中偏高,但由于出色的分离能力等因素,C18的应用范围越来越广泛。本文将介绍FLASH C18色谱柱的使用注意事项、使用维护方法以保持更长使用寿命并获得很好的分离效果。
编者语:FLASH(中低压快速制备液相)色谱纯化是色谱制备纯化中性价比高、应用范围广的一种色谱纯化手段。
使用前预平衡:
首先,新FLASH C18色谱柱须用甲醇或乙腈试剂低流速冲洗4~6个柱体积,使固定相能充分润湿、让碳链舒展开来以激活分离柱内填料表面键合的官能团,使色谱柱性能达到良好状态。其次,使用甲醇/水(体积比1:1)或乙腈/水(体积比1:1)体系继续对分离柱冲洗2个柱体积。最后,使用即将在下一步Flash制备色谱中采用的起始流动相对分离柱冲洗3~6个柱体积。
编者语:由于早期的C18的键合过程中会有残留的一些键合试剂,因此很多使用者习惯用强溶解性溶剂进行冲洗。但现在基本不会有残留,所以是否仍使用强溶解性溶剂取决于使用者的个人习惯。注意:考虑到残留的溶剂会让硅胶基质的填料凝固结块,造成柱压升高、效果变差以至无法使用,因此使用后,一定要用充分的甲醇将强溶剂冲洗出来。
使用过程中:水、酸、碱造成的影响
FLASH C18色谱柱水相影响:由于C18柱的固定相疏水性较强,在纯水(或水比例大于95%)环境下,C18官能团非极性排斥会使伸展状态的官能团在排斥力的作用下“倒伏”,使分析物难以与C18官能团接触,保留时间提前,出现肩峰等峰型变差情况,因此,在分离中尽量减少高水相或纯水相的分离时间。
编者语:水作为反相色谱流动相中的弱溶剂,大比例水相是可以增加化合物的保留,所以一般FLASH色谱反相纯化起始都是较大比例水相,这样水相塌陷致使C18柱寿命变短的情况是常见的,使用者只要用纯甲醇长时间过渡既能恢复一定使用效果。
FLASH C18色谱柱酸的影响:由于C18的化学结构是SI-O-C,在强酸条件容易断裂致使C18脱离失去分离效果,所以C18常规要在PH2以上。如果必须用PH2以下的流动相条件,建议用特殊键合工艺的C18,如多键键合C18(多层键合)。
FLASHC18色谱柱碱的影响:高PH条件下会破坏硅胶的SI-O-SI结构,所以通常硅胶基质的C18使用不能超过PH10。如果必须用PH10以上流动相条件,建议选用非硅胶基质的C18。
FLASH C18色谱柱盐的影响:如分离中使用盐成分,需用中等、高水相流动相进行充分的缓冲衔接,注意:不能用高有机相流动相冲洗含盐分的柱子,因为有可能析出盐结晶而堵塞柱子或破坏柱床。
编者语:由于其配比复杂及后处理等因素,酸碱盐在FLASH(中低压快速制备液相)色谱纯化用得不多,一般使用一些易挥发的氨水等。酸碱盐会虽对FLASH C18色谱柱寿命有影响,但对于一些特殊样品(如多酸碱性质样品)有很好的分离效果。关于酸碱盐在色谱分离中作用原理,后续有机会将给大家开个单章进行介绍。
使用结束后:
在FLASH C18色谱柱使用完成后,需使用纯有机溶剂(乙腈或者甲醇)对色谱柱进行冲洗,保证没有样品残留。如分离中使用盐成分,需先用高水相流动相再使用纯有机溶剂冲洗。
若FLASH C18色谱柱处于长期闲置状态时,要将其*冲洗,建议冲洗10CV以上,最后保存在纯有机试剂或高比例的有机试剂溶液中(如90%甲醇水,或者100%乙腈),且需要定期冲洗,防止柱床干涸,密封保存。
编者语:由于是干法装填,一旦FLASH色谱柱柱床内部的溶剂干涸,势必会造成柱床塌陷。
当C18被样品污染,柱压升高等情况的冲洗流程:
水→乙腈→异丙醇或其他强溶解性溶剂→乙腈
编者语:适用于情况,如柱压居高不下,柱床颜色冲不下。冲洗原则:1、根据样品选择强溶剂,对残留样品有强洗脱作用的流动相;2、冲洗标准是柱压恢复,柱床颜色恢复正常。
关于SepaFlashTM Bonded Series C18反相柱系列产品
三泰科技(常州)有限公司SepaFlashTM Bond Series C18反相柱系列产品具有多种规格(参见下表)。
超纯无定形C18硅胶,粒径40-63µm,孔径60Å
比表面积500m2/g,碳含量17%
产品编码 | 柱尺寸 | 上样量 | 流速(ml/min) | 柱长度 (mm) | 柱内径(mm) | 最大工作压力(psi/bar) |
SW-8201-0004-IR | 4 g | 5.9 mg–118 mg | 10-20 | 113.8 | 12.4 | 400/27.5 |
SW-8201-0012-IR | 12 g | 23 mg–0.46 g | 15-30 | 134.8 | 21.4 | 400/27.5 |
SW-8201-0025-IR | 25 g | 38 mg–0.76 g | 15-30 | 184.0 | 21.4 | 400/27.5 |
SW-8201-0040-IR | 40 g | 55 mg–1.1 g | 20-40 | 184.4 | 26.7 | 400/27.5 |
SW-8201-0080-IR | 80 g | 122 mg–2.5 g | 30-60 | 257.4 | 31.2 | 350/24.0 |
SW-8201-0120-IR | 120 g | 180 mg–3.6 g | 40-80 | 261.5 | 38.6 | 300/20.7 |
SW-8201-0220-IR | 220 g | 340 mg–6.8 g | 50-100 | 223.5 | 61.4 | 300/20.7 |
SW-8201-0330-IR | 330 g | 475 mg-9.5 g | 50-100 | 280.2 | 61.4 | 250/17.2 |
※ 兼容市场上所有快速液相制备色谱系统。
超纯球形C18硅胶,粒径20-45µm,孔径100Å
比表面积320m2/g,碳含量17%
产品编码 | 柱尺寸 | 上样量 | 流速(ml/min) | 柱长度 (mm) | 柱内径(mm) | 最大工作压力(psi/bar) |
SW-8222-0004-SP | 4 g | 5.4 mg–108 mg | 5-15 | 113.8 | 12.4 | 400/27.5 |
SW-8222-0012-SP | 12 g | 20mg–0.40g | 10-25 | 134.8 | 21.4 | 400/27.5 |
SW-8222-0025-SP | 25 g | 33mg–0.66 g | 10-25 | 184.0 | 21.4 | 400/27.5 |
SW-8222-0040-SP | 40 g | 48 mg–0.96g | 15-30 | 184.4 | 26.7 | 400/27.5 |
SW-8222-0080-SP | 80 g | 105mg–2.1 g | 20-50 | 257.4 | 31.2 | 350/24.0 |
SW-8222-0120-SP | 120 g | 155mg–3.1 g | 30-60 | 261.5 | 38.6 | 300/20.7 |
SW-8222-0220-SP | 220 g | 300 mg–6.0 g | 40--80 | 223.5 | 61.4 | 300/20.7 |
SW-8222-0330-SP | 330 g | 420 mg-8.4 g | 40-80 | 280.2 | 61.4 | 250/17.2 |
l ※ 兼容市场上所有快速液相制备色谱系统。
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