教学实验室医学真菌的保藏方法！

医学真菌作为自然界重要的生物资源，已成为微生物学实验中*的基本材料，应用频率较高。这其中部分为病原性真菌，而如何有效地保存保管好真菌菌种，以何种方式长期稳定地保持其生物遗传特性，则成为我们日常工作中需要研究探讨的问题。

一、材料与方法

1、教学实验室保存的菌种     
⑴单细胞真菌：白色念珠菌、新生隐球菌。
⑵多细胞真菌：黑曲霉菌、青霉菌、木霉菌。

2、医学真菌菌种的鉴定     
菌种使用前，均需进行形态学、生化学方面的鉴定，合格后方可使用。具体鉴定方法：(1)单细胞真菌：碳源发酵试验、产子囊孢子及芽管试验、咖啡酸试验、尿素酶试验；单细胞与多细胞真菌鉴定共用实验：玉米粉吐温80琼脂小培养显微镜下观察。(2)多细胞真菌：蛋白水解试验、37℃生长试验、温度试验、PDA小培养实验。

3、真菌菌种的保藏方法     
由于教学实验各时期使用的真菌菌种在数量及种类上不尽相同，所以与其相适应的培养方法与保管方式亦不相同。大体上分为定期传代保存法、超低温冻结保存法两种。

⑴定期传代保存法     
①液体培养基保存法：单细胞真菌接种于RPMI 1640培养基中,37℃培养24 h，取出后置4℃冰箱保存。该方法用于学期初低温冻结菌种的复苏、增菌培养。
②琼脂平板培养基保存法：学期开始，多细胞冻结菌种解冻后，划线接种于察氏平板培养基上面，28℃培养7～8  d，再将培养菌络移种于改良马丁平板培养基上，28℃培养7 d，待培养菌络生长良好,置4℃冰箱保存。为多细胞真菌的复苏与鉴定试验。
③琼脂斜面培养基保存法：单细胞真菌由液体培养基中多细胞真菌从马丁培养基表面，分别挑取菌种菌络，蜿蜒化线接种于各自相对应的琼脂斜面培养基中,经37℃或28℃培养生长良好后，置4℃冰箱保存备用。该方法用于学期中，真菌菌种即将使用，实验课前的菌种纯化和制备阶段。
④液体石蜡覆盖保存法：将无菌液体石蜡油覆盖于菌络生长良好的琼脂斜面真菌培养物表面，厚度约1 cm左右，置4℃冰箱保存。该法用于学期末对真菌菌种较长时期的保存方法。

⑵液氮超低温冻结保存法     
将单细胞或多细胞真菌培养物,以无菌生理盐水洗下并计数，加入等量脱脂牛奶保护剂，分装进安瓿后封口。选择菌种不同的适宜冷却速度，使瓿内菌悬液急速或慢速冻结成冰。置液氮超低温下保存。
 
二、结果
      
1、定期传代保存法     
⑴液体培养基保存法，可保存单细胞真菌15 d左右。
⑵琼脂平板培养基保存法，保存多细胞真菌15 d。
⑶琼脂斜面培养基保存法，保存单细胞、多细胞真菌1个月。
⑷液体石蜡覆盖保存法，可保存真菌菌种6个月。

2、液氮超低温冻结保存法     
可保存冻结菌种1年。

三、小结
        
一般认为，传代移种保存法保存的菌种，易失去病原性，而超低温保存法能够完整的保存菌种的致病性。为此，我们针对实验的初、中、末3个时期，对菌种的保存选择不同的保存方法，优化了菌种的遗传特性不变性。
            
实验显示，反复的移种传代会使菌种的致病力和生理活性下降，孢子形成能力减弱，故超低温冻结保存菌种，是保藏菌种的方法，不足的是菌种复苏启动时间较长。

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