活体组织氧化应激活性氧（ROS）MitoSOX红色荧光测定试剂盒说明书

活体组织氧化应激活性氧（ROS）MitoSOX红色荧光测定试剂盒（超氧阴离子superoxide）产品说明书（中文版）

主要用途

活体组织氧化应激活性氧（ROS）MitoSOX红色荧光测定试剂盒（超氧阴离子superoxide）测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂MitoSOX，在线粒体氧化损伤条件下，产生红色荧光，来检测细胞内超氧阴离子活性氧族的生成和增加的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。其中线粒体氧化磷酸化副产物之一是超氧阴离子，为线粒体内主要的活性氧族，与心血管疾病，包括高血压、冠状动脉硬化、糖尿病相关的血管疾病、神经退行性疾病（巴金森氏症、阿茨罕默症、肌萎缩硬化症）相关。MitoSOX是一种*自由通过细胞膜，并选择性在活体细胞线粒体内长期滞留而不外漏的染色剂。一旦被超氧自由基阴离子氧化，便产生荧光。据此证明细胞线粒体内超氧阴离子活性氧族的存在。

产品内容

  清理液（Reagent A）    毫升

  染色液（Reagent B）    微升

  稀释液（Reagent C）    毫升

  保存液（Reagent D）    毫升

产品说明书    1份

保存方式

保存  染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离

*细胞培养液（GMS12052）：用于细胞操作所需的培养基

15毫升锥形离心管：用于细胞操作的容器

1.5毫升离心管：用于细胞染色的容器

培养箱：用于反应孵育

血细胞计数仪：用于细胞计数

台式离心机：用于样品操作

比色皿或96孔板：用于荧光定量分析的容器

细胞流式仪：用于细胞荧光分析

（共聚焦）荧光显微镜：用于观察荧光细胞

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于细胞荧光定量分析

实验步骤

• 间接法

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的  染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，  稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升  染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升  稀释液（Reagent C），混匀后，标记为  染色工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。

• 准备1瓶25cm²细胞培养瓶的待测细胞
• 小心抽去细胞培养液
• 加入xx毫升   清理液（Reagent A）到细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面
• 小心抽去  清理液（Reagent A）
• 加入1毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面
• 置入37℃培养箱1分种
• 振动培养瓶，使细胞脱落
• 加入4毫升用户自备的*细胞培养液
• 移入15毫升锥形离心管，充分混匀（注意：悬浮细胞直接从这一步骤开始）
• 移取10微升在血细胞计数仪上进行细胞计数
• 移出1 X 10⁶细胞到新的15毫升锥形离心管
• 放入台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升含有  染色液（Reagent B）和  稀释液（Reagent C）的  染色工作液，轻柔混匀
• 放进37℃恒温水槽孵育20分钟，避免光照
• 放入台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入预冷的xx微升  保存液（Reagent D），轻柔混匀细胞颗粒群
• 放进冰槽里
• 选择下列方式之一进行操作：
  • 即刻进行细胞流式仪分析：藻红蛋白（phycoerythrin；PE）波段，观察50000个细胞以上――

波峰右移，表明超氧阴离子含量高

• 或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：

1）移取10微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片

2）激发波长510nm，散发波长580nm――

红色荧光增强，表明超氧阴离子含量高

• 或使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（定量检测）：

1）移取400微升上述细胞悬液到1毫升比色皿

2）加入xx微升  保存液（Reagent D）

3）上下倾倒混匀数次

4）放进荧光分光光度仪：激发波长510nm，散发波长580nm――

RFU增高，表明超氧阴离子含量高

• 直接法

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的  染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，  稀释液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升  染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升  稀释液（Reagent C），混匀后，标记为  染色工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。

1．准备1个细胞培养24孔板的待测细胞，细胞铺满率达70％

（注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和其它培养孔板，见注意事项5）

2．小心抽去细胞培养液

3．小心沿着孔壁加入xx微升含有  染色液（Reagent B）和  稀释液（Reagent C）的

  染色工作液到1个细胞培养孔，覆盖培养孔表面

4．放进37℃细胞培养箱里孵育20分钟

5．小心抽去含有  染色工作液 

6．小心沿着孔壁加入xx微升37℃预热的  保存液（Reagent D）到细胞培养孔

7．选择下列方式之一进行操作：

（A）使用倒置荧光显微镜观察（定性检测）：

激发波长510nm，散发波长580nm――红色荧光增强，表明超氧阴离子含量高

• 使用荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（定量检测）：

放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪：激发波长510nm，散发波长580nm――RFU增高，表明超氧阴离子含量高

注意事项

• 本产品为20次（1毫升体系）或40次（0.5毫升体系）操作
• 操作时，须戴手套
• 孵育时，避免光照
• 本产品适合各种规格的培养细胞：载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和各种培养孔板，须相应调整操作用量：

• 根据细胞类型，调整  染色工作液使用剂量（1：200至1：1000容量比），避免过度染色
• 建议细胞染色完成后，即刻进行细胞荧光分析
• 本公司同时提供系列超氧阴离子活性氧检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定荧光清晰