表面抗体可用于鉴定抗原特异性杂交瘤细胞

原始B细胞在其表面表达具有相同氨基酸序列和抗原特异性的抗体的多个拷贝。抗原刺激并分化为浆细胞后，通过RNA剪接和初级RNA转录物的加工将膜抗体转化为分泌的抗体，以去除疏水性跨膜锚。但是，RNA剪接在杂交瘤细胞中可能是不完整的，这将促进选择具有改变的结合特性的抗体。因此，我们使用免疫荧光染色来检测活杂交瘤细胞质膜上的免疫球蛋白。所有测试的分泌抗体的杂交瘤细胞，包括分泌IgG 1，IgG 2a，IgG 2b，IgG 3，与不表达免疫球蛋白的FO骨髓瘤细胞相比，IgM和IgM抗体在其表面显示中等至高水平的膜免疫球蛋白（图2A）。膜免疫球蛋白对杂交瘤细胞的功能活性通过用生物素化的聚乙二醇（PEG）或β-葡萄糖醛酸苷酶标记Alexa Fluor 647-缀合的链霉亲和素标记3.3（抗PEG）和7G8（抗β-葡萄糖醛酸糖苷酶）杂交瘤细胞来检查。 。3.3杂交瘤细胞特异性结合PEG但不结合β-葡萄糖醛酸苷酶，而7G8杂交瘤细胞结合β-葡萄糖醛酸苷酶但不结合PEG（图2B），表明膜免疫球蛋白显示出预期的抗原结合特异性。为了研究基于表面免疫球蛋白抗原结合的杂交瘤细胞高通量FACS是否可行，将7G8（抗β-葡糖醛酸糖苷酶）和3.3（抗PEG）杂交瘤细胞（99：1比例）的混合物染色，生物素化的PEG，然后与Alexa Fluor 647偶联的抗生蛋白链菌素孵育。可以清楚地区分两个不同的细胞群，对应于输入的7G8细胞和3.3个细胞的比例（图2C，左图）。收集结合PEG的杂交瘤细胞并培养5天。对扩增的杂交瘤细胞的分析表明它们可以结合PEG（图2C，右图），表明有效选择了3.3种抗PEG杂交瘤细胞。我们得出结论，分泌抗体的杂交瘤细胞在其表面上显示出足够的功能性免疫球蛋白，以允许鉴定和分离抗原特异性杂交瘤细胞。

图2.杂交瘤细胞上的膜免疫球蛋白分析。（A）在用山羊抗小鼠Ig和兔抗山羊FITC染色细胞后，通过流式细胞术检测在杂交瘤和FO骨髓瘤细胞上的膜结合免疫球蛋白。（B）在流式细胞仪上用生物素化的PEG或β-葡糖醛酸糖苷酶抗原，然后用Alexa Fluor 647-缀合的链霉亲和素，在3.3抗-PEG和抗β-葡糖醛酸糖苷酶7G8杂交瘤细胞上检测膜免疫球蛋白的功能性抗原结合。（C）以0.5：1生物素-PEG和Alexa Fluor 647-缀合的链霉亲和素对以99：1比例混合的7G8抗-β-葡萄糖醛酸苷酶和3.3抗-PEG杂交瘤细胞进行染色。用荧光激活的细胞分选仪收集结合生物素-PEG的杂交瘤细胞（左图），培养5天，然后用生物素-PEG和Alexa Fluor 647-链霉亲和素染色（右图）。

显示全尺寸

SHM的可控诱导

我们构建了组成型和诱导型载体，以允许在杂交瘤细胞中激活诱导的胞苷脱氨酶（AID）的可控表达。一旦鉴定出具有所需特征的抗体变体，就将这些载体设计为促进AID表达的终止。甲loxP位-flanked组成型表达盒（的pCMV-AID-loxP序列）（图3A）被用于通过慢病毒感染稳定转导3.3抗-PEG杂交瘤细胞，使3.3 / loxP位-aid细胞。如eGFP报告蛋白的荧光所示，AID在3.3 / loxP -AID细胞中表达（图3B，左侧面板）。为了测试是否可以“按需”停止AID的表达，通过DNA电穿孔将pLM-mCherry-P2A-Cre质粒转移到3.3 / loxP -AID细胞中。如通过mCherry表达可见，约23％的细胞表达Cre重组酶，对应于显示出降低的eGFP表达的细胞群（图3B，中间图），表明AID基因盒的缺失。可以通过FACS轻松分离eGFP阴性细胞（图3B，右图）。mCherry是瞬时表达的，因此在这些细胞中不再可检测到。为了确认AID基因的CRE依赖性缺失，从3.3细胞，3.3 / loxP -AID细胞或分选的Cre感染的3.3 / loxP制备的总细胞裂解液通过SDS-PAGE分离-AID细胞，并使用抗HA抗体通过Western印迹上的C端血凝素（HA）表位标签序列检测AID。在3.3 / loxP -AID细胞中检测到AID蛋白，但在Cre处理的3.3 / loxP -AID细胞中不存在AID蛋白（图3C），这表明AID可以通过Cre重组酶介导的杂交瘤细胞缺失而稳定表达并有条件地沉默。

图3. AID的可控制表达。（A）pCMV-AID- loxP载体的示意图。CMV立即早期启动子之后是小鼠激活诱导的胞苷脱氨酶（AID）基因，HA表位标签，弗林蛋白酶/ 2A肽（F2A）双顺反子表达接头和eGFP报告基因。AID盒两侧有两个loxP模体，用于Cre重组酶介导的基因切除。（B）在稳定表达pCMV-AID- loxP（3.3 / loxP）的3.3杂交瘤细胞中的eGFP（y轴）和mCherry荧光（x轴）-AID细胞，左图），以及通过DNA电穿孔用pLM-mCherry-P2A-Cre质粒瞬时转染后（中图），随后对eGFP阴性细胞进行了荧光激活的细胞分选（右图）。（C）将由3.3、3.3 / loxP -AID或经Cre处理的3.3 / loxP - AID细胞（经分选）制备的细胞裂解物免疫印迹以检测AID或微管蛋白上的HA表位标签，作为细胞上样对照。（D）自动调节pTetOn-AID质粒由四环素应答元件（TRE）启动子，AID基因，HA表位，弗林蛋白酶/ 2A肽（F2A）双顺反子表达接头，eGFP报告基因，IRES元件和rtTA-V14反式激活剂。（E）以指示的强力霉素浓度诱导48h的3T3 / TetOn-AID成纤维细胞中eGFP报告基因的流式细胞术直方图。（F）DsRed2s在AID的热点基序内的核苷酸位置519处含有过早的终止密码子。（G）在有（▲）或没有（○）强力霉素的条件下培养用pDsRed2s转导的3T3（■）或3T3 / TetOn-AID成纤维细胞，并通过FACS分析DsRed2的表达。显示了表达红色荧光（指示终止密码子的突变）相对于时间的细胞分数。

显示全尺寸

还构建了四环素诱导的AID表达盒（pTetOn-AID），作为AID表达可控诱导的替代方法。强力霉素可与rtTA-V14结合形成活性反式激活因子，从而在前馈环中启动由pTRE启动子驱动的DNA转录（图3D）。16，17稳定感染与多西环素的浓度梯度孵育两天显示的eGFP报告的剂量依赖性诱导，对应于AID的诱导型表达的3T3 /堤-AID的细胞（图3E）。为了检查AID是否具有功能上足以诱导SHM的功能，将3T3或3T3 / TetOn-AID细胞稳定转染了DsRed2基因，其中在RGYW / WRCY AID共有热点的情况下，酪氨酸173突变为琥珀色终止密码子主题（图3F）。通过添加强力霉素而在SHM启动后，仅在3T3 / TetOn-AID转染子中检测到18 DsRed2荧光（图3G）。我们得出的结论是，这些AID表达盒允许AID的可控表达以诱导SHM。

模拟体外生发中心反应

我们在3.3抗PEG杂交瘤细胞中表达AID，以分离在低温下以高亲和力与PEG结合的抗PEG抗体。这是通过扩增3.3 / loxP -AID细胞以允许SHM，在冰上用荧光标记的抗原（PEG）染色细胞，选择通过FACS结合多PEG的杂交瘤细胞以及将所选细胞扩增两周以允许继续进行而完成的SHM。初的选择是使用长链多价PEG分子进行的，但在随后的细胞分选中，PEG的长度和化合价逐渐降低。经过五轮连续的细胞扩增和分选后，将每轮分选后收集的杂交瘤细胞样品用Alexa Fluor 647-PEG 5K染色并在流式细胞仪上进行分析（图4A）。）。通过第五轮分选，与3.3 / loxP -AID杂交瘤细胞结合的Alexa Fluor 647-PEG 5K的平均荧光强度（MFI）为233，而亲代3.3杂交瘤细胞的值为23.2，表明这些杂交瘤细胞表达具有增强的PEG亲和力的抗体变体。在第五轮选择后，通过3.3 / loxP -AID杂交瘤细胞的单细胞分选分离出的三个杂交瘤克隆（1E3、1E10和2B5）观察到了相似的高PEG结合（图4B）。对来自3.3个亚克隆的免疫球蛋白可变区基因的序列分析表明，所有三种抗体变体在V H的构架1（FR1）中均表现出共同的A23V突变链和VL链的CDR2中常见的N53K突变（图4C）。此外，1E10和2B5抗体均在V L链的CDR2中具有A55P突变，而1E10抗体在V L链的CDR3中具有另一个突变S92T 。

图4.通过模拟生发中心反应分离温度依赖性抗PEG抗体。（A）将3.3 / loxP -AID杂交瘤细胞富集用于结合Alexa Fluor 647-PEG探针（y轴）的细胞。还使用Alexa Fluor 405偶联的山羊抗小鼠IgG Fc抗体（x轴）检测了表面免疫球蛋白。将细胞培养2周，然后每轮分选约3×10 7个细胞（S0-S5）。结果显示荧光标记的PEG的结合对表面Ig的水平。（B）PEG-Alexa Fluor 647与三个杂交瘤克隆（1E3、1E10和2B5）的结合，这些克隆是在选择的第5轮后从杂交瘤群体中分离出来的（S5）。（C1E3、1E10和2B5抗体与亲本3.3抗体的免疫球蛋白V H（上图）和V L（下图）基因序列的氨基酸序列和比对。使用网站http://www.bioinf。。ｏｒｇ.uk/abysis根据Kabat编号系统61分配抗体框架区和CDR 。

显示全尺寸

抗PEG抗体变体在低温下选择性结合PEG

我们评估了两种3.3抗体变体（1E3和2B5）与包被在微量滴定板中的PEG（10000 Da）的温度依赖性结合。2B5变体以比亲本3.3抗体更大的表观亲和力结合PEG，而1E3在4°C时大约和3.3结合，但两种变体抗体在25°C或37°C时都显示出逐渐降低的与PEG的结合（图5A） 。通过表面等离振子共振分析与PEG结合的抗体表明，在4°C下2B5和1E3与亲本3.3抗体表现出相似的亲和力，但在25°C下1E3和2B5对PEG的亲和力降低了85和185倍分别与它们在4°C下的亲和力进行比较（表1）。由于与PEG的结合力较弱，无法在37°C下确定1E3和2B5的亲和力。对于涂在微量滴定板中的其他长度的PEG，观察到了类似的1E3和2B5温度选择性识别（图S1）。我们还观察到，与亲本3.3抗体相比，1E3和2B5显示出长链PEG的结合增强，但与短PEG分子（即750 Da PEG）的结合降低。1E3和2B5抗体在高温下并不是天生不稳定的，因为即使在37°C下孵育5 d后，它们仍保留了完整的结合活性（图5B））。此外，通过差示扫描量热法测定的1E3和2B5抗体的解链温度（分别为73.6°C和74.2°C）实际上高于亲本3.3抗体（70.8°C），表明1E8和2B5抗体热稳定的（图5C）。这些结果表明，AID诱导的1E3和2B5抗体的免疫球蛋白V区基因突变赋予4°C优先结合PEG的能力。

图5.抗PEG抗体变体的温度依赖性结合和稳定性。（A）在温度下，将梯度浓度的纯化的3.3、1E3或2B5抗体添加到涂有线性氨基PEG（分子量10,000 Da）的微孔板孔中。1小时后，洗涤孔，并通过添加HRP缀合的驴抗小鼠IgG Fc抗体，然后添加ABTS底物来确定抗体结合。显示了三次测定的平均吸光度值（405 nm）。将Bars，SD（B）3.3（■），1E3（○）和2B5（▲）抗体在与CH 3 -PEG 5k -NH 2结合之前，于37°C孵育的时间。通过ELISA在4°C下测定96孔微量滴定板中的DNA含量。显示了通过测量ELISA中50％的大反应确定的相对于零时抗体活性的不同时间的抗体活性。（n = 3）。棒，SD（C），如在PBS中以1℃/ min的加热速率通过差示扫描量热法所测量的，热展开为3.3（黑线），1E3（绿色短虚线）和2B5（红色长虚线）。

显示全尺寸

CDR突变在温度依赖性PEG结合中的作用

为了确定哪些突变负责抗体变体2B5的温度依赖性结合，我们将2B5中的保守氨基酸突变（V H V23A和V L K53N）分别还原为亲本3.3抗体中的相应氨基酸（图6A）。V H V23还原为丙氨酸并不能消除2B5ΔV与PEG的温度依赖性结合（图6B）。相反，如在4℃，25℃和37℃下通过2B5ΔK与PEG的类似结合所观察到的，用天冬酰胺置换VL K53消除了2B5ΔK与PEG的温度选择性结合（图6B）。我们得出结论，V L K53突变负责2B5与PEG的温度依赖性结合。

图6. V L链K53负责2B5与PEG的温度依赖性结合。（A）重组2B5或2B5，其中V H V23（2B5ΔV）或V LK53（2B5ΔK）被相应的氨基酸取代从哺乳动物细胞培养基中纯化亲本3.3抗体。（B）重组2B5（■），2B5ΔK（○的分级浓度）或2B5ΔV（●）抗体在温度下添加到涂有线性氨基PEG的微孔板孔中。1小时后，洗涤孔，并通过添加HRP缀合的驴抗小鼠IgG Fc抗体，然后添加ABTS底物来确定抗体结合。显示了三次测定的平均吸光度值（405 nm）。酒吧，SD。

显示全尺寸

2B5结合可以被冠醚模拟的PEG结构

几项研究报告说，PEG可以配成赖氨酸残基，在蛋白质晶体表面形成冠状醚样结构。19 - 21因此，我们假设，2B5可识别构象PEG可以由冠醚来模拟（图7A。 ）。实际上，在4℃下18-crown-6以剂量依赖的方式*阻断了固定量的2B5与固定化的甲氧基-PEG 2k -NH 2的结合（图7B，上图）。相比之下，18-crown-6在亲本3.3抗体与PEG结合方面的竞争相对较弱（图7B，上面板）。18-crown-6不影响同种型匹配的抗β-葡萄糖醛酸苷酶控制抗体（7G8）与固定的β-葡萄糖醛酸苷酶的结合（图7B，下图），证明了竞争反应的特异性。我们进一步推断出，如果18-crown-6模拟在4°C形成的PEG结构，那么2B5应该在所有温度下都与结构明确的18-crown-6结合。因此，我们通过表面等离振子共振检查了2B5与固定在CM5芯片上的2-氨基甲基-18-crown-6在三种不同温度（4°C，25°C和37°C）下的结合。2B5在所有测试温度下均与固定的18-crown-6结合，而3.3和7G8抗体分别与固定的18-crown-6结合或相对不结合（图S2））。同样地，我们在4°C，25°C和37°C下检测到2B5与96孔ELISA板上包被的2-氨基甲基-18-crown-6的结合（图7C）。我们得出的结论是2B5结合到PEG结构，该结构优先在4°C形成，并且可以被18-crown-6模仿。

图7. 2B5可以结合冠醚结构。（A）18-crown-6，PEG400和2-氨基甲基-18-crown-6的化学结构的图示。（B）将梯度浓度的18-crown-6在4°C与10μg/ mL 3.3（○），2B5（■）或7G8（●）抗体混合，然后添加到涂有氨基PEG的96孔板中2k -NH 2（上图）或β-葡萄糖醛酸苷酶（下图）。结果显示抗体结合以大结合活性的百分比表示。（n = 3）。条形图，SD（C）纯化的3.3（○）的分级浓度），2B5（■）或7G8（●）抗体在涂有2-aminomethyl-18-crown-6的微孔板孔中于4°C，25°C或37°C孵育。4小时后，洗涤孔并通过加入生物素缀合的山羊抗小鼠IgG Fc抗体和链霉亲和素-生物素化的过氧化物酶复合物，然后加入ABTS底物来确定抗体结合。显示了三次测定的平均吸光度值（405 nm）。酒吧，SD。

显示全尺寸

2B5抗体对PEG化纳米颗粒的热亲和纯化

我们进一步探讨了是否可以将2B5抗PEG抗体用于PEG化化合物的轻度亲和纯化。将冷PBS（4°C）中的PEG-Qdots上样到装有琼脂糖珠的柱子上，琼脂糖珠的表面共价连接有3.3或2B5抗体（图8A）。用冷PBS洗涤色谱柱后，用柠檬酸盐缓冲液（pH = 3.0）或37°C PBS洗脱PEG-Qdot。3.3和2B5抗体均可在低温下捕获PEG-Qdot。用37°C PBS洗脱从2B5色谱柱中释放PEG-Qdot，而从3.3色谱柱洗脱PEG-Qdots需要进行酸洗脱（图8B）。这些结果表明，2B5可通过在4°C至37°C之间简单地热循环来温和纯化PEG化化合物。

图8. PEG化化合物的轻度亲和纯化。（A）PEG-Qdot655的温度依赖性亲和纯化的示意图。（B）将氧化的3.3或2B5抗体固定在Hydrarazide树脂上并装填到柱中。将PEG-Qdot655送入色谱柱，然后用冷PBS（4°C）洗涤色谱柱，然后用37°C PBS或柠檬酸盐缓冲液（pH = 3.0）洗脱。在IVIS 200光学成像系统（Xenogen）上检测到PEG-Qdot655的荧光。

显示全尺寸

抗体的原位分类开关重组

从IgM到生发中心其他抗体类别的抗体重链基因的CSR也取决于AID活性。22因此，我们检查了AID的表达是否可以促进类转换抗体的分离。pCMV-AID- loxP载体用于通过慢病毒感染稳定转导AGP4和3D8杂交瘤细胞。AGP4杂交瘤细胞分泌与PEG结合的单克隆IgM，而3D8杂交瘤细胞分泌与小鼠B16F10黑色素瘤细胞表面表达的抗原结合的单克隆IgM。23，24将杂交瘤细胞培养4周，然后用荧光标记的PEG（AGP4杂交瘤细胞）和PE偶联的山羊抗小鼠IgG（AGP4和3D8杂交瘤细胞）对活的杂交瘤细胞进行染色，然后通过FACS将单个阳性细胞分选到96孔培养板的各个孔。通过ELISA检查了AGP4 / loxP- AID和3D8 / loxP- AID克隆的培养基中抗体的重链类型。如所期望的，在亲代AGP4和3D8杂交瘤细胞的培养基中仅检测到IgM抗体（图9A和B）。相比之下，所有选定的AGP4 / loxP -AID和3D8 / loxP-AID杂交瘤克隆分泌了IgG抗体，证实了从IgM到IgG的类别转换。AGP4和3D8类转换抗体的同种型的进一步分析表明，它们都是IgG 3。如通过ELISA确定的，类别转换的抗体保留了抗原结合活性（图9C和D）。但是，对类别转换的3D8抗体的重链可变区基因进行测序后，发现AID共有热点中的氨基酸发生了变化（表S1），表明在CSR期间也发生了SHM。我们得出的结论是，模仿生发中心反应可以促进同时发生SHM的IgM向IgG抗体的快速转化。

图9.杂交瘤细胞中的快速重链类别转换。（A）将AGP4 / loxP- AID细胞培养4周，然后通过将单个细胞的荧光激活细胞分选到96孔板的孔中来克隆对表面IgG染色呈阳性的细胞。显示了来自亲本AGP4细胞和十个AGP4 / loxP- AID克隆的培养基中抗体的重链类别。（B）通过将单个细胞的荧光激活细胞分选到96孔板的孔中来克隆显示表面IgG的3D8 / loxP- AID细胞。显示了来自亲本3D8细胞和三个3D8 / loxP- AID克隆的培养基中抗体的重链类型。（C）通过ELISA在涂有PEG或对照β-葡萄糖醛酸苷酶抗原（n = 2）的平板中测定了来自十个所选AGP4 / loxP -AID克隆的培养基中AGP4 IgM或IgG抗体的平均结合率。Bars，SD（D）使用B16F10细胞作为抗原来源，通过FACS确定3D8，三个3D8 / loxP -AID克隆或对照AGP4杂交瘤细胞的培养基中抗体的结合。

显示全尺寸

细胞系和试剂

FO骨髓瘤细胞（PTA-11450），51个BALB / 3T3小鼠成纤维细胞（CCL-163），CC49（抗TAG-72的IgG 1 mAb，HB-9459），L6（抗人L6抗原的IgG 2a mAb，HB-8677） ，BC3（抗人CD3ε链的IgG 2b mAb，HB-10166）和PEG-1-6（抗流感病毒的Cg -189 IgG 3 mAb）杂交瘤细胞购自美国典型培养物保藏中心。杂交瘤细胞系AGP4（针对聚乙二醇的IgM mAb），3.3和6–3（针对聚乙二醇的IgG 1 mAb），7G8（针对人β-葡糖醛酸糖苷酶的IgG 1mAb）和3D8（针对B16F10黑色素瘤的IgM mAb）得到开发。我们的实验室，并进行了描述。24，52，赖明宗博士（中国科学院分子生物学研究所）友善提供了53枚人类293FT细胞。将所有细胞在Dulbecco氏补充有2.98克/ L HEPES，将2克/ L的NaHCO改进的Eagle培养基中培养3，10％胎牛血清（HyClone公司），100U / mL青霉素和100μg/ mL链霉素，在37℃下，在空气中含5％CO2的加湿气氛。甲氧基-PEG750-NH2，甲氧基-PEG1K-NH2，甲氧基-PEG2K-NH2，甲氧基-PEG3K-NH2羟基-PEG5K-NH2，甲氧基-PEG10K-NH2，甲氧基-PEG 20K -NH 2（750，1000，2000，3000，5000，10 000，20 000道尔顿，分别地），4-臂聚（环氧乙烷）10K -NH 2，2-氨基甲基-18-冠-6和18-crown-6购自Sigma-Aldrich。

DNA质粒构建

质粒pAS4w.1.Ppuro（图S3）包含用于强力霉素诱导基因表达的四环素响应元件启动子（TRE）（Tet-on系统），pLKO_AS3w.Ppuro（图S4）和pLKO_AS3w.Pneo（图。S5），其含有CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白（CAG）启动子用于cDNA的基因表达，和pLKO_AS3w.Ppuro-EGFP（图S6），其中包含一个EGFP基因，是慢病毒载体。这些质粒与pCMVΔR8.91包装质粒54和pMD.G VSV-G包膜质粒55一起从国家RNAi核心实验室（中国科学院基因组研究中心分子生物学研究所）获得。为了生成可终止的鼠类AID（AID）表达系统，我们设计了一个loxP侧翼为loxP -CMV-AID-HA-F2A-eGFP- loxP表达盒（pCMV-AID-loxP）。通过RT-PCR从BALB / c小鼠分离的脾细胞中克隆了HA标记的鼠激活诱导的脱氨酶（AID-HA）DNA的片段。为了监测AID-HA的表达，使用了基于弗林蛋白酶2A（F2A）56的双顺反子表达策略，将增强的绿色荧光蛋白（eGFP基因）连接到AID-HA基因的下游。从pLNCX-抗-PEG-eB7扩增含有HA标签和eGFP基因的一部分的HA-F2A-eGFP片段。57还通过PCR从pLNCX-抗-PEG-eB7克隆了CMV启动子。通过PCR从pLKO_AS3w.Ppuro-eGFP克隆了eGFP片段。然后通过组装PCR从CMV，AID-HA和F2A-eGFP片段中创建CMV-AID-HA-F2A-eGFP盒，并插入pLKO_AS3w.Ppuro质粒中，其中CAG启动子被CMV启动子替换。为了引入loxP位点，将退火的寡核苷酸分别插入CMV启动子上游的Spe I位点和eGFP下游的Pme I位点。将所得的质粒pCMV-AID-loxP与pMD.G和pCMVΔR8.91共转染到293FT细胞中，以产生重组慢病毒，该慢病毒用于感染杂交瘤细胞以将AID基因引入基因组。

我们还构建了可诱导的AID表达载体。通过PCR从pRetroX-Tet-On Advanced（Clontech Laboratories，Inc.）扩增rtTA-M2，然后使用多点定向诱变58进行突变，以获得rtTA-V14基因，该基因仅需10 ng / mL多西环素即可达到相似的效果在Tet-on系统中，当强力霉素为1000 ng / mL时，基因诱导水平为野生型rtTA。17通过组装PCR产生了IRES-rtTA-V14片段。将Nhe I-Pme I消化的AID-HA-F2A-eGFP片段和IRES-rtTA-V14片段插入pAS4w.1.Ppuro，以创建pAS4w.1.Ppuro-AID-F2A-eGFP-IRES-rtTA-V14 ，表示为pTetOn-AID。

从pDsRed2（Clontech Laboratories，Inc。）扩增出编码DsRed2基因的DNA的片段，并插入到pLKO_AS3w.Pneo中以产生pAS3w.Pneo-DsRed2。通过使用QuikChange TM定点诱变试剂盒（Stratagene）进行定点诱变，将琥珀终止密码子引入核苷酸位置519 18的pAS3w.Pneo-DsRed2中，以产生pDsRed2s。

PEG和β-葡萄糖醛酸苷酶的生物素化

将溶于2 mg / mL DMSO的4arm-PEG 10K -NH 2，甲氧基-PEG 5K -NH 2和甲氧基-PEG 2K -NH 2（Laysan Bio，Arab，AL）与6倍（对于4arm-摩尔过量的EZ-link NHS-LC-生物素（Pierce）或AlexaFluor®647琥珀酰亚胺酯（PEG 10K -NH 2）或2倍（对于甲氧基-PEG 5K -NH 2和甲氧基-PEG 2K -NH 2）摩尔过量Invitrogen（在DMSO中）在室温下放置2小时，以生产生物素化的4arm-PEG 10K或Alexa Fluor 647共轭的甲氧基-PEG 5K和甲氧基-PEG 2K， 分别。这些化合物在DDH的5倍体积稀释2 O和透析（分子量截止〜12个000-14 000道尔顿）相对于双蒸水2 O操作除去游离EZ-链路NHS-LC-生物素或Alexa氟647。同样，将人β-葡萄糖醛酸苷酶59以2 mg / mL的浓度溶于PBS（pH 8.0）中，然后在室温下与20倍摩尔过量的EZ-link NHS-LC-生物素混合2小时，以产生生物素化的β-葡糖醛酸糖苷酶。加入十分之一体积的1M甘氨酸溶液以终止反应。将生物素化的β-葡萄糖醛酸苷酶对PBS进行透析，以除去游离的EZ-link NHS-LC-生物素，进行无菌过滤并保存在-80°C。

杂交瘤细胞膜结合免疫球蛋白的分析

小鼠免疫球蛋白在活杂交瘤细胞上的表面表达是通过用2μg/ mL山羊抗小鼠Ig（ICN Pharmaceuticals）或山羊抗大肠杆菌抗体（Abcam）对含有0.05％BSA的PBS进行阴性对照染色来测量的在4°C下放置1小时。将细胞用冷PBS洗涤3次，并用2μg/ mL FITC缀合的兔抗-（山羊IgG F（ab）' 2）抗体（ICN Pharmaceuticals）染色。3.3和7G8杂交瘤细胞也用生物素化的4arm-PEG 10K染色（0.5 nM）或生物素化的β-葡萄糖醛酸苷酶（5μg/ mL）在汉克平衡盐溶液（HBSS），2％FBS中在4°C下放置30分钟，然后用Alexa Fluor 647偶联的抗生蛋白链菌素（2μg/ mL）（Jackson ImmunoResearch Laboratories）在4°C下放置30分钟。通过用冷PBS洗涤两次除去未结合的探针。在BD™LSR II流式细胞仪（Becton Dickinson）上测量10 4个活细胞的表面荧光，并用Flowjo（Tree Star）进行分析。

慢病毒将AID基因转导入杂交瘤细胞

通过使用45μLTransIT-LT1转染试剂将7.5μgpCMV- AID-loxP或pTetOn-AID与6.75μgpCMVΔR8.91包装质粒54和0.75μgpMD.G VSV-G包膜质粒55共转染来包装重组慢病毒颗粒。（Mirus Bio）在10厘米培养皿（90％融合度）中生长的293FT细胞中。48小时后，收集慢病毒颗粒，并通过在4°C下以50 000xg超速离心1.5小时进行浓缩。将慢病毒颗粒悬浮在含有5μg/ mL聚乙烯的培养基中，并通过0.45μm过滤器过滤。将杂交瘤细胞接种在6孔板中（1×10 5病毒感染前一天）。将含有慢病毒的培养基添加到细胞中，然后将其离心1.5 h（500xg，32°C）。在含有嘌呤霉素（5μg/ mL）的*培养基中选择细胞，以产生稳定的3.3 / loxP -AID，AGP4 / loxP -AID或3D8 / loxP -AID细胞。

细胞中AID的条件表达

在存在或不存在强力霉素的情况下，通过在3.3 / loxP -AID和3T3 / TetOn-AID细胞中检测eGFP报告基因，在BD™LSR II流式细胞仪（Becton Dickinson）上测量细胞中AID的相对表达水平。为了检查是否可以停止AID表达，在电穿孔溶液（Mirus Bio）中用5μgpLM-CMV-mCherry-P2A-Cre 60 DNA（Addgene）转染了3.3 / loxP -AID杂交瘤细胞（2.5×10 6个细胞）使用BTX电穿孔仪（275电压，15毫秒脉冲长度）。将细胞在6孔板中培养48小时，然后在BD™LSR II流式细胞仪上分析eGFP和mCherry荧光。转染pLM-CMV-mCherry-P2A-Cre 3.3 / loxPDNA转染后10天，在FACSAria细胞分选仪上分离出eGFP表达阴性的-AID细胞。要直接测量细胞中的AID蛋白水平，请使用5×10 6将3.3或3.3 / loxP-AID杂交瘤细胞在0.5 mL RIPA缓冲液（1％NP-40、150 mM NaCl，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，50 mM Tris，pH 8.0）中于4°C裂解1小时。通过12.5％还原SDS-PAGE分析澄清裂解物中的50μg总蛋白，将其转移到硝酸纤维素纸上，并依次用针对HA表位标签序列YPYDVPDYA（载体实验室）或兔抗微管蛋白α的生物素化山羊抗HA抗体染色抗体（NeoMarkers），然后分别是抗生蛋白链菌素-HRP和山羊抗兔Ig-HRP（Jackson ImmunoResearch Laboratories）。通过ECL检测（Pierce）可视化条带，并使用LAS-3000 Mini Fujifilm成像系统（FujiFilm）分析条带。

SHM分析

用DsRed2s慢病毒感染3T3或3T3 / TetOn-AID细胞，以生成3T3 / DsRed2s或3T3 / TetOn-AID x DsRed2s细胞。在有或没有500 ng / mL强力霉素的情况下培养细胞。在限定的时间收获细胞并进行流式细胞术以测量DsRed2信号，该信号指示过早终止密码子的突变以允许全长DsRed2蛋白的表达。计算DsRed2阳性细胞的百分比，并报告为回复体/ 10 6个细胞。

通过模拟生发中心反应分离抗PEG抗体变体

为了分离抗PEG抗体变体，将3×10 7 3.3 / loxP-AID细胞培养两周，然后在HBSS，2％FBS中用生物素化的4arm-PEG 10K（100 pM，1×10 6细胞/ mL）染色在4°C孵育30分钟，然后在4°C与5 mL的Alexa Fluor 647偶联的抗生蛋白链菌素（2μg/ mL）和PE偶联的山羊抗小鼠IgG Fc抗体（2μg/ mL）孵育30分钟测量膜结合的免疫球蛋白水平。通过用冷PBS洗涤两次除去未结合的探针。在FACSAria细胞分选仪上收集显示高Alexa Fluor 647荧光的细胞（占总细胞的1％），并培养2周，然后再次分选细胞。PEG链的长度和PEG探针的分支从4arm-PEG 10K逐渐降低，线性PEG 5K和线性PEG 2K。5轮后，将单个3.3 / AID细胞收集到96孔板中，并通过将pLM-CMV-mCherry-P2A-Cre瞬时转染到杂交瘤克隆中来终止AID表达。

抗体生产与纯化

在15 mL培养基（DMEM，5％FBS）中将2.5×10 7的所选3.3 / loxP -AID变异杂交瘤细胞（1E3和2B5）接种到CELLine CL 1000两室生物反应器（INTEGRA Biosciences AG）中。每7天收获含抗体的培养基，然后通过蛋白A Sepharose 4 Fast Flow色谱法（GE Healthcare）纯化。收集的抗体针对PBS进行透析，并进行无菌过滤。抗体浓度通过双辛可宁酸（BCA）蛋白测定法（Thermo Scientific）确定。

抗体2B5的定点诱变

通过RT-PCR从2B5杂交瘤cDNA中克隆了重组2B5抗体基因。2B5轻链和重链DNA通过pLNCX-抗PEG-eB7中的复合弗林蛋白酶2A双顺反子表达肽接头连接。将经EcoR I-Pme I消化的2B5 IgG片段插入pAS3w.Ppuro中以产生pAS3w.Ppuro-2B5。V H V23A和V L的定点诱变K53N在50μL混合物中进行，混合物包含20 ng pAS3w.Ppuro-2B5模板DNA质粒，每个引物15 pmole，dNTPs 20 nmole，2 U Phusion高保真DNA聚合酶（Thermo Scientific）在1 x Phusion缓冲液中。热循环在95°C进行0.5分钟的初始变性; 在95°C下进行18个循环0.5分钟，在55°C下进行1分钟，在68°C下进行11分钟。冷却至≤37°C后，将2 U Dpn I限制酶（NEB）直接添加到37°C的扩增反应中1.5 h。通过热激法，将四微升Dpn I消化的样品用于转化DH5α感受态细胞。通过慢病毒转导产生稳定分泌2B5 / V23A（2B5ΔV）和2B5 / K53N（2B5ΔK）抗体的3T3细胞，并如上所述在嘌呤霉素（10μg/ mL）中进行选择。

抗体ELISA

将Maxisorp 96孔微孔板（Nalge-Nunc International，Roskilde，丹麦）用0.5μg/孔的甲氧基-PEG 750 -NH 2，甲氧基-PEG 1K -NH 2甲氧基-PEG 2K -NH 2，甲氧基-PEG 3K-包被。 NH 2羟基-PEG 5K -NH 2，甲氧基-PEG 10K -NH 2，甲氧基-PEG 20K -NH 2或4臂聚环氧乙烷10K -NH 2（50μL/孔）0.1 M NaHCO 3 / Na 2一氧化碳3（用HCl调节至pH 8.0）缓冲液在37°C下放置3小时，然后在4°C下用200μL/孔稀释缓冲液（PBS中5％脱脂奶）封闭过夜。将抗体在37°C下预孵育长达5 d，以检查热稳定性。将在50μL2％脱脂乳中的PBS中浓度分级的抗体在4°C，RT或37°C下添加1小时。将板分别用PBS在4℃，RT或37℃下洗涤3次。在4°C，RT或37°C下将50μL稀释缓冲液中的HRP偶联驴抗小鼠IgG Fc（2μg/ mL）加入1小时。如上所述洗涤板。为了进行竞争性ELISA分析，将maxisorp 96孔微孔板用0.5μg/孔的氨基PEG 2K -NH 2包被。或如上所述的人β-葡糖醛酸糖苷酶。制备了从120 mM开始的18-crown-6的3倍系列稀释液，并与20μg/ mL的3.3、2B5或7G8抗体1：1（v / v）混合（因此抗体的终浓度为10μg / mL）。将混合物在4℃下添加到板中1小时。将板在4℃下用PBS洗涤3次，然后在4℃下与缀合有HRP的驴抗小鼠IgG Fc（2μg/ mL）一起温育1小时。对于冠醚ELISA分析，如上所述，将maxisorp 96孔微孔板用0.5μmol/孔2-氨基甲基-18-crown-6包被。在4°C，25°C或37°C下，将50μL2％脱脂乳的PBS中的抗体（3.3、2B5或7G8）的分级浓度添加到板中4小时。将板分别用PBS在4℃，25℃或37℃下洗涤两次。在4°C，25°C或37°C下将50μL稀释缓冲液中的生物素偶联山羊抗小鼠IgG Fc（2μg/ mL）（Jackson ImmunoResearch Laboratories）添加1小时。如上所述在不同温度下洗涤板。将5微克生物素化的过氧化物酶（Invitrogen）和10μg链霉亲和素（Thermo Scientific）在室温下于15 mL PBS中预孵育30分钟，以允许形成复合物，然后将50μL加入孔中。未结合的抗体在4°C，25°C或37°C下用PBS洗涤四次。在所有情况下，通过加入150μL/孔ABTS溶液[0.4 mg / mL，2,2'-叠氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），0.003％H 将5微克生物素化的过氧化物酶（Invitrogen）和10μg链霉亲和素（Thermo Scientific）在室温下于15 mL PBS中预孵育30分钟，以允许形成复合物，然后将50μL加入孔中。未结合的抗体在4°C，25°C或37°C下用PBS洗涤四次。在所有情况下，通过加入150μL/孔ABTS溶液[0.4 mg / mL，2,2'-叠氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），0.003％H 将5微克生物素化的过氧化物酶（Invitrogen）和10μg链霉亲和素（Thermo Scientific）在室温下于15 mL PBS中预孵育30分钟，以允许形成复合物，然后将50μL加入孔中。未结合的抗体在4°C，25°C或37°C下用PBS洗涤四次。在所有情况下，通过加入150μL/孔ABTS溶液[0.4 mg / mL，2,2'-叠氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），0.003％H在室温下用2 O 2和100 mM柠檬酸磷酸酯（pH 4.0）处理30分钟。在酶标仪（Molecular Device）中测量孔的吸光度（405nm）。

IgG的Fab片段化

将木瓜蛋白酶（Sigma-Aldrich）溶解在补充有20mM 1-半胱氨酸和20mM EDTA（PBS-Sigma）的PBS中的终浓度为0.1mg / mL，然后将pH调节至7.2。将等体积的纯化的3.3、1E3或2B5抗PEG抗体（2 mg / mL）添加到木瓜蛋白酶溶液中，并在37°C下孵育2.5小时。加入十分之一体积的0.3M碘乙酰胺溶液（Sigma-Aldrich）以终止反应。通过在PEG亲和柱上进行亲和色谱纯化3.3、1E3和2B5抗PEG Fab片段，方法是将1g CNBr活化的Sepharose 4B（GE Healthcare）在1 mM HCl（pH 3）中溶胀30分钟，然后用偶联缓冲液（0.1 M NaHCO 3，pH 8.3）并加入五摩尔甲氧基-PEG 30K-mL胺（Laysan Bio）/ mL凝胶在偶联缓冲液中于25°C放置4 h。通过在25°C下向凝胶中添加1/10体积的1M Tris（pH 8），封闭CNBr活化的琼脂糖凝胶上剩余的活性基团2小时。将PEG偶联的Sepharose用含有0.5M NaCl的0.1M乙酸盐缓冲液（pH 4）洗涤，然后用含有0.5M NaCl的0.1M Tris（pH 8）洗涤。将木瓜蛋白酶消化的抗体在4°C上样到PEG-树脂柱上45分钟，并用冷PBS洗涤以去除木瓜蛋白酶和Fc片段。用100 mM甘氨酸缓冲液（pH 3）洗脱结合PEG-树脂的抗PEG Fab片段，并用PBS透析。

鸡蛋清溶菌酶的聚乙二醇化

三毫克/毫升鸡蛋白溶菌酶（HEL）（Sigma-Aldrich公司）的PBS（pH8.0）中，用4倍摩尔过量的甲氧基PEG的混合2K在25 2小时-succinimidylpropionate（为Shearwater Polymers提供）℃至生产单聚乙二醇化的HEL（PEG 2k-HEL）。加入十分之一体积的1M甘氨酸溶液以终止反应。通过在Sephacryl S-300 HR柱上的凝胶过滤除去未反应的PEG。PEG 2k -HEL的浓度通过BCA测定（Thermo Scientific），以牛血清白蛋白作为参考蛋白来确定。

通过表面等离振子共振分析抗PEG抗体的结合动力学

在4℃，25℃和37℃下，在Biacore T-200（GE Healthcare）上测量3.3，1E3和2B5抗PEG Fab片段的结合动力学。通过使用标准程序通过EDC / NHS反应进行胺偶联，将PEG 2k -HEL固定在CM5芯片（GE Healthcare）上。总共固定了57个共振单元（RUs）。在HEPES缓冲盐水中以各种浓度的抗体以65μL/ min的恒定流速确定结合。

抗体的热稳定性

将抗体在PBS中透析，脱气，然后以0.5 mg / mL的浓度添加到差示扫描量热仪（Nano DSC III）（TA Instruments）的样品室中。将脱气的PBS注入参比室。在将每个抗体-缓冲液对在3 atm的固定压力下以每分钟1°C的速率从10°C线性加热到110°C时，监测差分功率。还使用与抗体样品相同的步骤收集缓冲液（脱气的PBS）扫描进行基线扣除。

通过表面等离振子共振将抗体与冠醚结合

在确定的温度下，在Biacore T-200（GE Healthcare）上测量抗体对18-crown-6化合物的结合活性。通过使用标准程序通过EDC / NHS反应进行胺偶联，将2-氨基甲基-18-皇冠-6固定在CM5芯片上。以10μL/ min的恒定流速将2-aminomethyl-18-crown-6（10 mM在50 mM硼酸钠缓冲液中，pH 8.5）注射到EDC / NHS活化的CM5芯片中，持续30分钟。通过注射乙醇胺使剩余的琥珀酰亚胺酯失活。总共固定了279.4个共振单位（RUs）。在4°C，25°C和37°C的HEPES缓冲盐水中，以1μM的抗体以50μL/ min的恒定流速进行抗体结合分析。

通过抗PEG抗体亲和纯化PEG化的纳米颗粒

通过在抗PEG抗体树脂柱上的亲和色谱法纯化PEG-Qdot655纳米颗粒。简短地，将偶联缓冲液（0.1 M乙酸钠，0.15 M氯化钠，pH 5.5）中的5 mg 3.3或2B5抗PEG抗体与10 mM偏高碘酸钠（Thermo Scientific Pierce）在室温下于黑暗中反应， 30分钟。在Zeba™Spin脱盐柱上除去偏高碘酸钠，然后将氧化的抗体与1 mL含0.1 M苯胺的Ultradid Hydrazide树脂（Thermo Scientific）在室温下孵育4小时。将抗PEG树脂填充到柱中，并用PBS洗涤3次。将500微升PEG-Qdot655溶液（在PBS中为32 nM）在4°C加载到3.3或2B5抗PEG色谱柱中。用冷PBS洗涤柱，并用37℃PBS或100mM柠檬酸盐缓冲液（pH ＝ 3）洗脱结合的PEG-Qdot655纳米颗粒。将颗粒转移到Nunc F96 MicroWell黑色聚苯乙烯板（200μL/孔）中，并在IVIS 200光学成像系统（Xenogen）上检测到PEG-Qdot655的荧光（激发/发射：450 nm / 660 nm）。

免疫球蛋白ELISA

将Maxisorp 96孔微孔板用0.5μg/孔的山羊抗小鼠IgG + IgA + IgM（Jackson ImmunoResearch Laboratories）包被在50μL/孔的0.1 M NaHCO 3 / Na 2 CO 3中（用HCl调节至pH 8.0）缓冲液在37°C下放置3小时，然后在200°L /孔的稀释缓冲液（PBS中5％脱脂奶）中在4°C封闭过夜。将在50μL2％脱脂牛奶（1：100）中稀释的杂交瘤上清液在室温下加入板中1小时。将板用PBS洗涤3次。在室温下将HRP偶联的兔抗小鼠IgG，IgA或IgM（MP Biomedicals，2μg/ mL）加入50μL稀释缓冲液中1小时。如上所述洗涤板。通过在室温下添加150μL/孔ABTS溶液30分钟来测量结合的过氧化物酶活性。在酶标仪中测量孔的吸光度（405 nm）。根据制造商的说明，使用Mouse MonoAb-ID试剂盒（Zymed Laboratories）确定类别转换的AGP4和3D8抗体的同种型。

类转换3D8抗体变体的FACS分析

将B16F10细胞在4°C下用3D8或3D8 / loxP-AID细胞的培养上清液染色30分钟。将细胞用冷PBS洗涤3次，并用2μg/ mL PE-缀合的PE-抗山羊IgG Fc抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories）染色。通过用冷PBS洗涤两次除去未结合的抗体。在BD™LSR II流式细胞仪上测量10 4个活细胞的表面荧光，并用Flowjo进行分析。