本文要点：本文作者系统研究了主发射峰位于近红外一区（NIRⅠ700-900nm）的生物相容性花菁染料的尾发射区域（>1000nm），筛选出的NIR染料在NIR-II区域具有明亮的尾发射，并具有高量子产率、高摩尔消光系数、排泄速度快和适用于生物偶联的官能团，从而可用于多种生物模型NIR-II实时成像，有望促进NIR-II生物成像的临床转化。

荧光成像是一种被证实的高灵敏度、实时跟踪生物靶标的方法，近已扩展到近红外二区成像（1000-1700nm），相比于近红外一区（700-900nm），近红外二区波段的光在生物组织中吸收更少，散射系数降低，此外生物自体荧光也在该波段大大减少。当前这一领域的研究主要集中在纳米科学和生物学的交叉领域，为NIR-II纳米荧光团的体内生物成像开辟了新的机会，但是，考虑到临床转化前景，由于潜在的免疫原性反应，基于纳米材料的NIR-II荧光团成像后在体内的保留和积累引起了人们的关注。目前仍无临床获批的具有高亮度和生物相容性的NIR-II荧光染料。吲哚菁绿（ICG）作为目前获得FDA批准的NIRⅠ成像试剂，已经广泛用于临床血管造影术和手术灌注评估，IRDye800CW目前正在进行反应性修饰的多个临床试验评估，已广泛应用于NIR-I窗口的蛋白/抗体标记和分子靶向成像，但在NIR-I区域成像深度仍然有限。利用目前临床批准的或商业化的NIRⅠ花菁染料的尾发射进行NIRⅡ成像是个很有前景的思路，然而，对其尾部发射机理的研究还未进行过，本文作者就此展开对尾发射机理的研究。NIRⅠ的荧光发射并不遵守Franck-Condon原理，同时由于硅检测器对超过900nm的光探测效率低下，因此大于900nm的发射光谱并未产生肩峰，作者通过系统研究筛选出可生物共轭的NIRⅠ染料IR-12N3，其在NIRⅡ区具有明亮的尾发射峰，并对该染料进行了NIRⅡ尾发射机理研究。作者认为，NIRⅠ花菁染料在S1激发态下π域的不对称导致扭曲的分子内电荷转移（TICT）过程，被确定为引起明亮的NIR-II发射的原因。利用NIR-II区域的出色亮度，与NIR-I成像相比，高对比度和高信噪比的靶器官和肿瘤深层组织成像得以实现，在小鼠体内施用IR-12N3可以实现非常清晰的血管成像和深部淋巴结成像。

作者首先对一系列市售的NIR-I染料的相对量子产率进行了筛选，发现花菁染料如IR-12N3、ICG和IRdye800是亮的NIR-I染料，在血清中具有明亮的尾部发射，所有的商用NIR-I花菁染料都可以简化为四种类型的母核结构，如下图1a所示，典型的花菁染料有两个吲哚基和交错的乙烯键，不同的取代基允许控制发色团的性质，如吸收波长、光稳定性、荧光和溶解度，就以IR-12N3为例，这些NIR-I染料具有较强荧光，其发射峰位于800nm左右（图1b），由于硅基探测器的探测效率较低，在发射光谱的长波长处缺少肩峰。随后作者使用InGaAs探测器记录超过900nm的发射光谱，检测到了合理的尾发射峰（图1c）。由于这些染料和蛋白质之间具有较强的相互作用，作者测试了牛血清白蛋白（BSA），胎牛血清（FBS）和PBS中荧光强度随温度的变化，结果显示IR12N3-FBS复合物实现了亮度增强（图1d），在FBS中，IR-12N3的亮度分别比IRDye800和ICG高2到3倍（图1e）。为了系统研究这种尾发射的现象，作者进行了密度泛函理论（DFT）和时间相关DFT计算（图2a）。母核1（图2d上方）和母核4（图2d下方）的占据分子轨道（HOMO）和未占据分子轨道离域在整个分子骨架上，表明了具有强烈的π-π*局域激发特征。激发态下的母核1的键2和键4的键长以及母核4的键2-4的键长显著增加，随着扭转角度的增加，展现出了单键的特征（图2b），这更加有利于这些键的扭转，尤其是母核4会更加明显，但是需要注意的是，4号母核中环己基的空间位阻作用可以阻止沿着键4的旋转，并且比母核1更有利于产生不对称构型。在基态下分子为平面型，激发态下中间C-C键有被拉长的趋势，因此在S1激发态更加容易扭转（图2f），该扭转会破坏π-共轭骨架的对称性，结果使得电荷重新分布，，进一步诱导TICT过程（图2e），对周围环境更为敏感的TICT -S1态主要通过位于NIRⅡ区的红移发射从而回归基态。

图1：a）商业化花菁素的一般母核结构。母核1：ICG，母核2：IR820和IR830，母核4：IR12-N3、IRDye800、IR783；b)使用硅基探测器测量NIR-I染料(760 nm激发)的吸收和发射，人为地截断了低能量发射肩峰；c）在InGaAs探测器上测量NIR-I染料的发射 (808激发)具有更高的灵敏度，在NIR-II光谱区域恢复真实的尾发射；d）染料分别与BSA和FBS加热孵育10min后NIRⅠ亮度增加；e）IR-12N3-FBS复合物的NIRⅠ量子产率是IRDye800 CW/ICG-FBS复合物的2-3倍

图2：a）ICG母核结构1和IRDey800/IR12-N3的母核结构4；b）理论计算母核1的键2键长和母核4的键3键长与扭转角度的变化曲线；c）模拟的母核1和母核4的荧光发射波长随扭转角度的变化曲线；d）母核1（上）与母核4（下）的HOMOs与LUMOs示意图；e）母核1（上）与母核4（下）的静电势面示意图；f）尾发射和扭转分子内电荷转移(TICT)示意图。

参考文献

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红外二区小动物活体荧光成像系统 - MARS 

NIR-II in vivo imaging system 

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