传代细胞株体外培养、鉴定与形态观察！

1、标本采集
在无菌条件下于健康产妇分娩后立即取新生儿脐带， 挤出脐带血管中的血液，放入装有含青链霉素的PBS液瓶中，2h之内行脐静脉内皮细胞培养。
双抗：青霉素100u/ml; 链霉素100μl/ml
PBS：KCl 0.2 g/L, KH2PO4 0.24 g/L, NaCl 8.0g/L, Na2HPO4•7H2O 1.56g/L或Na2HPO4 1.44 g/L。 在800ml蒸馏水中加入上述质量物质，用盐酸调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高压蒸汽灭菌20分钟，室温保存。
 
2、原代血管内皮细胞的获取与培养
在无菌条件下取新生儿脐带，剪去钳痕和凝阻塞部分，找到脐静脉。一端插上带有胶管的玻璃管结扎固定，经胶管接注射器，用生理盐水灌洗。待脐静脉内的残血除净后，用37℃ PBS，冲洗两次，将另一端用铁夹夹闭，向脐静脉内灌注0.25%胰蛋白酶8～10ml，夹闭胶管放入已灭菌的大平皿中。37℃孵育12min，在此期间经常翻动脐带使酶溶液在血管内流动以促使内皮细胞均匀与酶接触。取出脐带后轻轻挤压管壁，将含有内皮细胞的胰蛋白酶注入50ml锥形离心管中，加入小牛血清2ml终止酶反应。再以30ml PBS冲洗管腔，流出液一并入离心管，1000r/min离心10min，弃上清，加入含有10%小牛血清的DMEM [或IMDM（Dibco）？]培养液，充分混合制成细胞悬液。取0.1ml细胞悬液在血细胞计数板计数。后调细胞数，以1×105/ml接种至24孔培养板中，每孔1ml。置于5%CO2，37℃静止培养24h更换培养液，以除去未贴壁的细胞。以后每隔2d换液1次，以维持细胞的营养和内环境的稳定。
胰蛋白酶溶液（100ml）配制：
1）将D-Hanks（橙红色）液高压消毒灭菌，用NaHCO3液调节pH至7.2左右。 
2）称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许消毒的盐溶液调成糊状，然后再补足盐溶液，搅拌混匀，置室温4小时或冰箱内 ，并不时搅拌振荡。 
3）次日先用滤纸粗虑，再过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱或－20℃保存备用，常用浓度为0.25％或0.125％；胰蛋白酶溶液（深红色）偏酸，使用前用NaHCO3调pH至7.2左右。
D－Hanks液配制：
KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06 g/L , NaCl 8.0g/L, NaHCO3 0.35 g/L,
Na2HPO4•7H2O 0.06g/L, 酚红 0.02 g/L
 
3、传代内皮细胞的培养
原代内皮细胞融合后用培养液冲洗两次，然后用0.25%胰酶加入到内皮细胞中，每孔0.3ml。边消化边在倒置显微镜下观察。细胞皱缩、彼此分离或呈大片状分离即可终止消化。加入含有10%小牛血清的培养液，吸管吹打，制成细胞悬液，计数后按105个细胞/ml，继续培养。
 
4、血管内皮细胞的鉴定
1）倒置显微镜观察细胞的形态特点。
2）VWF相关抗原免疫荧光检查：在24孔塑料培养板孔内放置无菌的盖玻片0.5cm×0.6cm，每孔中种植1ml含有105个细胞的原代或传代内皮细胞悬液。待内皮细胞生长至近融合状态时，取出盖玻片，用PBS冲洗3次，投入冷丙酮中（-18～-20℃），细胞面向上，作用7min，用PBS冲洗3次，每次1min，而后进行间接免疫荧光检查，抗体为鼠抗人VWF单克隆抗体，1∶20倍稀释，加入50μl于盖玻片上，放入湿盒内4℃ 。同时不加一抗做阴性对照。用PBS冲洗3次后，加入异硫氢酸标记的二抗50μl，放入37℃2h后，用PBS洗涤3次。然后立即在荧光显微镜下观察，摄片。 血管内皮细胞鉴定结果： VWF相关抗原间接免疫荧光检查，原代及传代培养的内皮细胞浆中有黄绿色的荧光着色，胞核呈黑绿色，整个细胞轮廓清楚。作为对照的内皮细胞片子中，偶见绿色斑点散发荧光，未见细胞轮廓。
 
5、内皮细胞体外生长情况  
用胰蛋白酶消化的人脐静脉内皮细胞，接种在24孔塑料培养板各孔内4h后，大部分细胞贴壁。早期细胞呈小多角、球形、呈团状，少数细胞伸展，48～72h生长，逐渐生长成梭形，有些细胞排列呈鱼贯状相连，间有旋祸状排列。核清晰，呈圆形或椭圆形，核分裂相多见，1～2核仁，胞浆丰富，内含小颗粒。于3～4d后融合，7～10d胞体呈多角形，相互嵌合，为单层呈铺路石状排列。

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