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荧光定量pcr仪定量方法之-定量

来源:上海巴玖实业有限公司   2021年01月09日 21:55  

在做qPCR实验时,我们经常会问:“你是做定量还是相对定量呢?”,而定量方法的选择是取决于实验的目标。定量可测定目标核酸分子的实际拷贝数,但也是费力、复杂的定量形式。此方法要求周密的实验方案和高度准确的标准曲线,常用于确定病毒滴度。

使用标准曲线进行定量

定量是通过样品的Cq值和标准曲线进行比较实现的。首先为了建立标准曲线,需要已知拷贝数浓度的标准品,对标准品进行5次以上的连续梯度稀释,将稀释的标准品进行实时荧光定量PCR扩增,后根据各样品的拷贝数浓度及相应的Cq值绘制标准曲线,得到线性方程Cq= -klgX0+b,其中X0为起始模板量。然后将未知样本的Cq值与此标准曲线进行比较,确定其拷贝数浓度。

从图1可以发现,当模板起始浓度越大时,荧光达到阈值的循环数越少,即Cq值越小。反之,模板起始浓度越小时,Cq值越大。起始模板量的Log值与循环数Cq值呈线性关系,通过已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线,即可确定未知待测样本中目的基因的量。

如何选择标准品?

如前所述,生成标准曲线采用的模板将决定数据的准确度。所以使用与实验样本尽可能类似的目标模板,可优选有证的标准物质或参考物质。那么制备标准品的常见方法如下:

☑  DNA 标准品:目的靶点的PCR扩增片段或含有目的靶点的质粒克隆(图2)。

优点:易于生成、定量,可在适当的储存条件下维持稳定性。

缺点:无法进行qRT-PCR 的逆转录步骤,大大影响了反应效率。

PCR扩增片段:通过常规PCR进行目的片段扩增,回收纯化PCR扩增片段,可直接作为标准品,相对于质粒,PCR扩增片段不是那么稳定。

质粒克隆:将目的片段进行PCR扩增,回收目的条带后连入T载体,再进行质粒提取,OD值定量,将质粒梯度稀释作为标准品使用。

☑  RNA 标准品:目的靶点的体外转录RNA(图3)

优点:结合了RT效率,程度地模拟了目的靶点。

缺点:需要耗费时间生成该标准品,因其不稳定,难以保持长期准确度。

体外转录RNA:利用实时荧光定量PCR生成的PCR 产物可利用包含5’ T7启动子的序列和包含 3’ poly(T) 的逆转录引物重新扩增。体外转录反应生成多聚腺苷酸化正义mRNA。纯化后可将其准确定量并稀释,用于生成标准曲线。

Azure  Cielo™实时荧光定量PCR系统——定量示例

 

•方法:从组织中提取基因组DNA,以TaqMan探针法进行荧光定量检测

•试剂:PerfeCTa qPCR ToughMix UNG(QuantaBio)

 

 

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