碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定原理

实验原理

碱性磷酸酶（alkaline phosphatase EC 3.1.3.1简称为ALPase）广泛存于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中，ALPase起了及其重要的作用。在生物体内ALPase与磷的代谢直接相关，参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase的作用适PH在碱性区域，一般在PH9.0~10.5范围内。Mg²⁺对该酶的活力有显著的激活使用。

为了获得好的提取效果，在酶的制备过程，特别应注意以下几点：

1. 选取来源丰富、酶含量高的新鲜材料。提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温下保存。
2. 用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。碳酸铵是常用的盐。操作时，要注意保持缓冲液的合适PH值和温度。在加碳酸铵时需事先将其研细，需缓慢加入并及时搅拌溶解，尽量防止泡沫形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。盐析生成的沉淀，要静置20min以上，以使沉淀*，然后方可时行离心分离。
3. 有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯。丙酮和乙醇是使用广泛的两种有机溶剂。应注意在低温下操作，缓慢加入，充分搅拌，避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变性。离心收集沉淀后，立即将其溶于适量缓冲液中，以避免酶活力的丧失。
4. 在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步聚才有效。

     酶活力的分析：通常是以对—硝基苯磷酸二纳（pNPP)为底物，在PH10.1的碳酸盐缓冲液（含2mmol/L Mg²⁺）的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯（ pNP）在405 nm处有大的吸收峰，可以根据OD_4〇5值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为在37℃下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L  Mg²⁺的测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。

蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂(Folin-Phenolreagem)显色法，详见北京来亨科贸有限责任公司技术文章。