细胞组织蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性荧光定量检测试剂盒

MB50047.3.1 v.A

  细胞组织蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性荧光定量检测试剂盒产品说明书

（中文版）

主要用途

  细胞组织蛋白酶B（CATHEPSIN B）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过二肽化合物底物z-FR-AMC，在组织蛋白酶L抑制剂的存在下，受到组织蛋白酶B的水解，释放出荧光产物氨甲基香豆素，即采用荧光法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体、植物、昆虫等）组织蛋白酶B（CATHEPSIN B）的特异活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

组织蛋白酶（CATHEPSIN），是一种木瓜酶（papain）类半胱氨酸或天冬氨酸蛋白酶（Cysteine or Aspartic protease），普遍存在于溶酶体细胞器内，在酸性环境下激活，切离各种目标蛋白。根据其结构和底物特异性，组织蛋白酶家属约有十多种成员，包括A、B、C、D、E、G、H、K、L、S等。组织蛋白酶在细胞内蛋白和细胞外蛋白通过内吞进行周转中起着重要作用，同时也是启动和传递细胞凋亡信号的替代机制，以及肿瘤和炎症性组织损伤的病理生理变化。其中组织蛋白酶B（EC 3.4.22.1），又称为CTSB，作为溶酶体的标志性酶蛋白，可以使β-淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein）转化为β-淀粉样蛋白斑点（β-amyloid plaque）在抗原处理（antigen processing）、肿瘤转移、骨再吸收、细胞内或分泌性调节蛋白周转、卵细胞成熟、细胞凋亡等方面具有重要作用。细胞间接触和细胞外基质成分影响43kd组织蛋白酶原L转化为成熟蛋白。组织蛋白酶B使胶原蛋白、结缔组织蛋白、β-淀粉样前体蛋白等降解。与半胱氨酸蛋白酶抑制剂A和B（Cystatin A和B）、S100A10等蛋白相互反应。组织蛋白酶B异常，将导致阿茨罕默综合症（Alzheimer's disease）、食道肿瘤（esophageal adenocarcinoma）等疾患。基于人工合成的二肽化合物底物z-FR-AMC（z-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin；乙酰苯丙氨酰精氨酰氨甲基香豆素），在组织蛋白酶L抑制剂Z-FY(t-Bu)-DMK的存在下，受到组织蛋白酶B的水解，释放出荧光7-氨基-4-甲基香豆素（7-amido-4-methylcoumarin；激发波长360nm；散发波长460nm），来定量测定组织蛋白酶B的特异活性。组织蛋白酶B反应系统为：

CATHEPSIN B

z-FR-AMC       →          z-FR  +   AMC

             Z-FY(t-Bu)-DMK

产品内容

  清理液（Reagent A） 120毫升

  裂解液（Reagent B）  10毫升

  缓冲液（Reagent C）   2毫升

  底物液（Reagent D）   500微升

  标准液（Reagent E）  50微升

产品说明书      1份

保存方式

保存  清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；  底物液（Reagent D）和  标准液（Reagent E）避免光照和反复冻融；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞

微型台式离心机：用于样品沉淀

培养箱：用于反应物孵育

96孔板或比色皿：用于样品荧光测定的容器

荧光酶标仪或荧光分光光度仪：用于样品荧光分析

实验步骤

• 样品制备

• 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）
• 小心加入3毫升  清理液（Reagent A），覆盖生长表面
• 小心抽去清理液
• 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升  清理液（Reagent A），混匀细胞
• 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升  裂解液（Reagent B），充分混匀
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于冰槽里孵育30分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测定准备

• 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液样品等），置于冰槽里
• 设定好荧光分光光度仪（温度为37℃）：激发波长360nm，散发波长460nm，并置零 
• 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
• 分别加入25微升  缓冲液（Reagent C）到2至5号管
• 移取50微升  标准液（Reagent E）到1号管，混匀
• 小心移取25微升1号管稀释的  标准液（Reagent E）到2号管，混匀
• 小心移取25微升2号管稀释的  标准液（Reagent E）到3号管，混匀
• 小心移取25微升3号管稀释的  标准液（Reagent E）到4号管，混匀
• 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

• 标准曲线测定

• 移取70微升  缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入20微升  底物液（Reagent D）
• 加入10微升上述配制的标准液
• 上下倾倒数次，混匀
• 在37℃温度下孵育60分钟
• 即刻放进荧光分光光度仪检测：获得相对荧光读数（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 重复实验步骤1至6四次
• 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位（RFU）；横座标（X轴）为标准AMC浓度（微摩尔/升）

• 样品测定

• 移取70微升  缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入20微升  底物液（Reagent D）
• 加入10微升待测样品（50微克细胞裂解萃取液蛋白）（注意：样品须清澈）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在37℃温度下孵育60分钟
• 即刻放进荧光分光光度仪检测：获得样品相对荧光读数（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 根据标准曲线获得样品对应AMC浓度

• 计算样品实际活性

[根据标准曲线获得样品对应AMC浓度（微摩尔/升）X样品稀释倍数]÷ 60（分钟）＝纳摩尔/毫升•分钟÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝纳摩尔/毫克•分钟

• 酶标仪测定

• 在96孔板上做好相应标记：标准样品和待测样品
• 分别移取70微升  缓冲液（Reagent C）到相应孔里
• 分别加入20微升  底物液（Reagent D）
• 分别加入10微升上述配制的标准液或待测样品（50微克细胞裂解萃取液蛋白）（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动96孔板
• 在37℃温度下孵育60分钟
• 即刻放进荧光酶标仪检测：获得相对荧光读数
• 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位；横座标（X轴）为标准AMC浓度（微摩尔/升）
• 根据标准曲线获得样品对应AMC浓度
• 样品实际活性计算：

根据标准曲线获得样品对应AMC浓度（微摩尔/升）X样品稀释倍数]÷ 60（分钟）＝纳摩尔/毫升•分钟÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝纳摩尔/毫克•分钟

注意事项

• 本产品为20次操作
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，标准曲线测定只需1次
• 样品须澄清，且避免反复冻融  
• 建议待测样本蛋白浓度为50微克/10微升（本公司提供    Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 孵育反应完成后即刻进行荧光测定
• 可以使用组织蛋白酶B抑制剂CA-074作为抑制剂对照或阴性对照
• 组织蛋白酶B单位活性定义为：在37℃，pH 5.5条件下，每分钟内能够切离1微摩尔二肽化合物底物z-FR-AMC所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列组织蛋白酶学检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感