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   发光细菌法(Microtox)是环境样品毒性检测的生物测试技术，并已被列入德国国家标准(DIN38412)和标准(ISO11348)。毒性是一项综合的生物学参数，它是衡量样品对活性生物体所产生的影响，不能以化学分析的方法进行测定，而其他的生物测试方法如鱼类试验、浮游动物试验、藻类试验等则较为复杂，且必须使用高等生物进行试验，从而引起众多的争议。发光细菌测试使用了具有发光特性的天然微生物，而毒性物质则将抑制起发光，且毒性越强光抑制越明显，这一方法经研究被证实具有快速、简便的特点，同时有很好的灵敏度和可靠性。另外，发光细菌本身没有危害性。

发光细菌毒性检测的整个过程在60分钟之内，发光抑制率通过测定起始和终止状态时的细菌发光值并计算得到，测试的结果有如下两种：

l光抑制率，通过计算直接测定样品的毒性

l稀释因子GL，在DIN的分析中，将样品稀释成系列浓度并测定每个稀释浓度的抑制率，其中造成20%或20%以下抑制率的样品稀释度即为GL

德国政府的相关法规及应用

化学工业的废水、填埋场渗出液和工业冷却水必须通过发光细菌的毒性测试。同时，德国联邦环境部门正在起草制定合适的指导性技术，从而对其他的工业部门进行监督。发光细菌试验是取代鱼类毒性试验的方法之一，并且已在Bavarian地区进行了试点。

德国水管理法(WHG)规定对填埋厂渗出液和工业冷却水进行发光细菌毒性测试，这些废水的毒性将造成严重的问题，如生物污水处理系统和地表水的破坏，因此，WHG明确规定了废水排放的毒性限制：

l填埋场渗出液经常具有较严重的污染，GL=4

l工业冷却水的污染部分是由于生物杀灭剂，GL=12

l现在起，化学工业的废水也被规定进行发光细菌毒性测定，GL=32

废水监测的目标是含盖90%以上的部门，包括医院废水（其中被发现存在毒素），大量使用清洁剂和表面活性剂的部门（如食品和饮料业），石油工业等。根据WHG的规定，必须对20个以上的部门所排放的废水以鱼类试验进行毒性监测，Bavaria地区于1993年起采用了发光细菌和Daphania的试验代替鱼类试验，该模式现在已被全德国所接受，其结果等同于鱼类试验。在鱼类试验、浮游动物试验、藻类试验和发光细菌的毒性测试比较中，发光细菌法为敏感，被测出毒性的废水比例高。

表1. 不同工业部门发光细菌毒性检测的规定（德国联邦环境办公室，1998）

GX: 稀释因子，样品不产生毒性效应的

GF: 鱼类试验，GD: daphania试验，GA: 藻类试验，GL: 发光细菌试验

欧盟和美国的相关政府指导性文件：

欧盟关于边界河流水质控制的指导性文件：

由于毒性物质排放所造成的污染，所以需通过生物试验对环境水样、沉积物、流出物进行毒性测定，从而为环境和生态系统的安全提供早期的预警。环境样品毒性测定所选用的方法所要考虑的因素包括：方法的灵敏度、快速性，方法要能覆盖较广范围的化学毒性物质。其所列出的排放物、环境水、沉积物的毒性测试方法包括发光细菌法(Microtox)、浮游生物(D.magna)、藻类、鱼类试验等，其中Microtox方法的特点是反应快速、操作简便。

美国环保局(EPA)全废水毒性试验：污染物测定程序的指导性文件：

EPA对于排放物的控制的经典方法是实行对特定化学物质的指标限制，但是在实际的环境样品中人仍存在很多未知的化合物，另外，化合物的毒性效应是所有组成物质拮抗作用或抑制作用的综合结果，所以单纯的化学物质的限定不能为水体的安全提供充分的保障。在此情况下，EPA和各州的环保局正开始使用生物学的方法对排放物的毒性进行测定（而不是传统的毒物的化学分析），从而判定环境样品的综合毒性效应。EPA在1994年所颁布的“全废水毒性控制方案”即指出采用毒性指标来控制通过NPDES程序的污染物的排放。方案指出，流出物的生物毒性检测是水质控制的重要方面。关于生物试验的方法，目前有鱼类试验、浮游动物试验等，虽然Microtox试验尚未列入正式的测试方法，但EPA已经指出该方法可以作为一项毒性筛选试验，并且承认其是一种有效的毒性检测的工具。

使用发光细菌进行毒性检测的原因：

发光作用是发光细菌正常生理状态下所具有的性质，它是细胞呼吸作用的副产物，而呼吸作用则是细胞和生物代谢的基本过程，细菌的发光直接和其呼吸相关，当细胞活性受到毒性物质作用后，其活性将受到抑制，从而使呼吸速率下降，进而导致发光降低，样品的毒性越强，发光细菌的光损失越多，以细菌发光法测定样品的毒性已经被证明是一种方便、可靠的生物传感方法。

Microtox急性毒性检测系统概述：

该系统使用冻干的发光细菌制剂，通过15分钟的暴露试验，测定其代谢的抑制情况，从而计算出样品（水样、土壤样品）的毒性。该方法以通过工业、研究和政府的试验被证实有效，至今，已有超过500的关于Microtox系统应用和评价的论文。同时该测试方法已在多个国家被认可为标准，包括ASTM(D-5660)。ISO11348-3（水质测定—水样对于发光细菌的抑制效应测定）的草案也已经得到批准。加拿大已经批准该方法为常规的测试应用于石油钻井中的排水监测。另外，这一方法已被提交美国环保局作为全废水毒性测定(WET)的测试，从而作为国家污染和排放物减除系统(NPDES)中一项新方法。

Microtox试验的灵敏度：

目前，公开的数据库中已经保存了1200种以上化学物质的Microtox测试的EC50值。

Microtox试验的准确性：

Microtox试验已经进行了充分的重复性试验，包括实验室间的比较，证实其变异系数在20%以内，与化学分析方法类似，明显优于其他生物学测试。

Microtox试验的应用：

该方法已广泛、成功地应用于环境和过程的监测，具体包括：

l污水处理场的流入液的检测，以保护活性污泥的生物活性；

l污水处理厂的流出液的检测，以保护受纳水体的安全；

l毒性减低评价(TRE’s)和毒性鉴定评价(TIE’s)；

l表层水的监测以确定点源污染和非点源污染；

l生饮水的检测；

l沉淀物的测定；

l土壤污染的检测及其恢复过程的监测；

l工业过程中水体中生物杀灭剂的检测

关于使用Microtox试验进行饮用水监测的情况：

使用Microtox试验监测饮用水的原因：

   Microtox试验是建立在生物传感器基础上的毒性检测系统，它能有效地检测突发性或破坏性的水源污染，已有多个国家将该系统应用于饮用水的监测。在美国，城市中偶发的和蓄意性的污染特别引起关注，本方法可以在15分钟内快速地完成检测，从而对水质的变化作出迅速的反应，另外，Microtox试验快速筛选结果的可靠性及其操作的简便性、成本的合理性也使之成为重要点源上水质的常规监测的有效手段。

Microtox试验对特定情况下的饮用水的检测：

美国*的供水系统和华盛顿地区的供水管道都使用该检测方法对饮用水进行监测，从而保护平民和军事人员免受引水污染的危害。

1984年洛山矶和1996年亚特兰大奥运会期间、1991年海湾战争以及2000年民主党全国代表大会期间都采用了该方法对饮用水的处理和分配系统进行连续的监测，以保证饮水的安全。

Microtox试验的检测范围：

经过近20年的科学研究，已经证明该方法对数千中不同类型的化学物质具有敏感的效应，其反应的毒性物质包括重金属、农药、真菌杀灭剂、杀鼠剂、有机溶剂、工业化合物等。

下表列出了部分毒性物质及其Microtox试验的检测限

不使用直接化学分析的原因：

   对于综合性样品的处理研究表明，特异性化学分析测定未知样品的毒性仅占毒性检测的20%，化学分析虽然灵敏、准确，但由于时间、费用以及对样品的不可知性使其在毒性的实际筛选中受到很大限制，另外，混合样品中不同的化合物彼此之间存在着协同或拮抗作用，所以毒性作用并非单一物质作用的加减，因此必须使用生物方法对综合的毒性效应（尤其对于未知物）进行测定。目前所应用的生物检测主要包括：鱼类试验、藻类试验、D.magna试验和Microtox试验，前三种试验周期长、操作复杂，而Microtox试验解决了上述问题，并且数据的准确性和重复性也明显提高。

测试仪器的简便性：

   Microtox试验所使用的仪器小巧，便于携带，可用于实验室研究和分析，同时也可在现场或野外进行原位即时的监测。

发光细菌毒性检测的原理：

发光细菌体内的荧光素酶催化荧光素的氧化作用，反应如下：

FMNH2+O2+R-CO-H→FMN+R-COOH+H2O+Light

从而产生生物发光，它直接与细胞的活性及代谢状况相关。毒性物质将改变细胞的状态，包括细胞壁、细胞膜、电子的转移系统、酶及细胞质的结构，这些变化将导致生物发光的减弱。通过生物发光光强的测定即可计算得到样品毒性的强弱。

Modern Water公司microtox检测系统

使用活体生物的检测技术是测定水样和土壤样品所存在和潜在毒性的*可靠的方法，Modern Water经过多年的发展与改进，在生物毒性试验和仪器准确性结合的基础上发展了生物毒性检测系统，使Microtox检测系统变得更加便携，。

发光细菌毒性检测近期研究论文：

Microtox试验作为一种新的有效的医疗仪器和器材的安全检测方法。

J Biomater Appl 1998 Oct; 13(2): 166-171

城市地下水质量快速生物检测方法的比较，生物检测能准确、有效地测定环境对地下水的毒性影响，而Microtox试验较之D. magna试验具有更好的重复性。

Chemosphere 2002 May; 47(5): 547-54

废水毒性的评价：Microtox试验和活性污泥氧吸收抑制试验的比较，Microtox试验具有很高的灵敏度，是测定污水处理厂废水毒性的有效工具。

Water Res 2002 Feb;36(4): 919-24

应用Microtox试验检测Albufera国家公园的水质毒性

Chemosphere 2002 Jan;46(2): 355-69

检测药物在水中的毒性，首先使用Microtox试验对不同的药剂进行毒性试验

J Chromatogr A 2001 Dec 14;938(1-2):187-97

三种商品化生物发光毒性检测系统对化学毒性的测定

Water Res 2001 Oct;35(14):3448-56

运用生物发光毒性检测技术对石油污染的土壤进行生态危害评价

Environ Toxicol Chem 2001 Jul;20(7):1438-49

金属工厂废水毒性测定方法的比较，Microtox试验和鱼类试验

两者具有很好的相关性，而Microtox试验更适合于工业废水的监测

Environ Toxicol 2001;16(2)136-41

Microtox试验对于有机磷杀虫剂及其代谢产物毒性的研究

Aq. Tox. 1994: 30(3):259-270

发光细菌毒性检测研究报告：

   美国能源部Los Alamos实验室(LANL)使用Microtox试验对特殊的含放射性物质的污水排放物进行原位的快速监测，结果也证明了该方法的灵敏、快速以及分析成本较低、操作简便。

   法国环境科学中心毒理实验室对Microtox试验和D.magna试验进行了比较，对39种化合物的实验结果显示两者的一致率达86%，而Microtox试验更为方便，更适合对工业排放物进行毒性筛选。

   瑞士实验室的研究结果表明，Microtox试验能够很好地测定土壤中残留的农药及其主要代谢产物的毒性。

   科威特地球环境科学研究部门的环境科学实验室使用Microtox试验对排放入Shuaiba湾的工业废水对海水所造成的毒性进行研究，发现部分样品产生中等的毒性效应，并有季节性的变化。

   荷兰阿姆斯特丹的Omegam环境研究所运用Microtox试验等的毒性实验方法对阿姆斯特丹地区9个淡水系统的沉积物的孔隙水(pore water)进行毒性检测研究，其中3个根据荷兰污染控制法的规定要求存在较严重的污染。

   香港科技大学生物研究中心运用Microtox试验对维多利亚港的海水沉积物进行分析发现其中部分样品存在重金属污染所造成的毒性。

   意大利米兰的水研究所使用Microtox试验对意北部的Orta湖的沉积物进行了毒性研究，发现人造纤维工厂附近的区域由于铜和氨的排放，孔隙水中有较明显的毒性。

   密歇根大学的研究人员应用Microtox试验、D.megna试验和Chironomus tentans试验对底特律河的沉积物的毒性进行研究，结果显示Microtox试验的时间短也敏感。

   巴尔第摩水与废水局面对随时可能的毒性物质的超标排放，开始执行排放物的毒性控制以保证水质，毒性排放监测的方法中即包括了Microtox试验。

   西班牙农业部门的研究发现，环境水体中包含了很多未知的组成物质，其效应是多种因素的综合作用，因此其对环境的危害性影响的判别很复杂，而Microtox试验是对混合样品的毒性进行评价的很好工具。

   荷兰的公共健康和环境保护实验室运用Microtox试验对莱茵河的河水进行实时监测，由于试验只需15分钟，因此如发现毒性问题，可立即采取措施，是河水在进入荷兰后其毒性物质和作用逐步降低。

   美国环保局的一项研究报告指出，暴风雨引起的污水存在一定的毒性，使用Microtox试验对其进行的研究表明，9%的暴风雨污水(stormwater)经分析具有显著的毒性效应。

   以色列的研究人员的研究结果认为Microtox试验由于其经济性和管理操作的可行性，因此是工业园区污染源监控处理的一种有效工具。

   美国的研究发现家禽养殖场除了营养物质以外还包含了许多毒性化学物质，通过发光细菌的毒性试验可以快速地发现养殖场排放和渗出液中所存在的毒性。

   美国海洋资源部门对船坞渗出液的研究发现木材防腐剂存在着毒性作用(Microtox试验)，从而对河口水环境造成污染。

   在水质监测分析方面，发光细菌法(Microtox)以其快速筛选，结果的可靠性及其操作的简便性、成本的合理性等优点，必将为水质的监测，带来便利以及更美好的前景。

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