细胞肌酸激酶（CK）总活性酶连续循环反应光谱法定量检测试剂盒

细胞肌酸激酶（CK）总活性酶连续循环反应光谱法定量检测试剂盒

产品说明书（中文版）

主要用途

  细胞肌酸激酶（CK）总活性酶连续循环反应光谱法定量检测试剂是一种旨在通过磷酸因子和ATP能量转换反应系统中，直接测定与ATP水解对应的ATP合成过程中，伴随的磷酸肌酸的去磷酸反应，进而由己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶连续循环法反应系统中，伴随的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的还原反应，即采用光谱法测定其还原后峰值的变化，以分析样品中酶活性的&而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物或人体）肌酸激酶的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

肌酸激酶（creatine kinase；CK），又称为磷酸肌酸激酶（creatine phosphokinase；CPK），主要在骨骼肌、平滑肌和脑组织中表达。肌酸激酶由两个亚基组成：B型（脑组织型）或M型（肌组织型）；构成3个不同同功异构酶：：CK-BB（CK-1）、CK-MB（CK-2）和CK-MM（CK-3）以及CK-Mt（线粒体型）。肌酸激酶的增高表明肌肉的损害，与机体受伤、横纹肌溶解症（habdomyolysis）、心肌梗塞（myocardial infarction）、肌炎（myositis）、心肌炎（myocarditis）、恶性体温升高（malignant hyperthermia）和抗精神病药导致恶性综合症（neuroleptic malignant syndrome）等有关。肌酸激酶的降低表明酒精性肝病和风湿性关节炎。肌酸激酶通过消耗ATP催化肌酸转化成磷酸肌酸的反应，产生ADP。在这一能量转换反应系统中，直接测定与ATP水解对应的ATP合成过程中，伴随的磷酸肌酸的去磷酸反应，进而通过己糖激酶（hexokinase）的催化，ATP磷酸化葡萄糖，产生6-磷酸葡萄糖（glucose-6-phosphate），继续在6-磷酸葡萄糖脱氢酶（glucose-6-phosphonate dehydrogenase；G6PDH）的作用下，生成6-磷酸葡萄糖酸（6-phosphogluconate；6-PG），同时氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）转化为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH），其吸光峰值的变化（340nm）， 来定量测定肌酸激酶的总活性。其反应系统为：

产品内容

  清理液（Reagent A）     毫升

  裂解液（Reagent B）     毫升

  缓冲液（Reagent C）     毫升

  反应液（Reagent D）     毫升

  阴性液（Reagent E）     毫升

  底物液（Reagent F）     毫升

产品说明书     1份

保存方式

保存  反应液（Reagent D）和  底物液（Reagent F）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

细胞刮脱棒：用于脱离细胞

（微型）台式离心机：用于样品操作

恒温水槽：用于孵育反应

比色皿：用于光谱分析的容器

分光光度仪：用于光谱分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

• 样品准备

• 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）
• 小心加入xx毫升  清理液（Reagent A），覆盖生长表面
• 小心抽去清理液
• 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入xx毫升  清理液（Reagent A），混匀细胞
• 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升  裂解液（Reagent B），充分混匀
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于冰槽里孵育30分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测定准备

• 准备好待测样品，置于冰槽里 
• 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长为340nm，间隔30秒，读数7次（共3分钟），并置零 
•    缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取xx微升  缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升  反应液（Reagent D）
• 加入xx微升  底物液（Reagent F）
• 放进37℃培养箱里孵育3分钟
• 加入xx微升  阴性液（Reagent E）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数3分钟－340波长读数0分钟 

• 样品活性测定

• 移取xx微升  缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升  反应液（Reagent D）
• 加入xx微升  底物液（Reagent F）
• 放进37℃培养箱里孵育3分钟
• 加入50微升待测样品（注意：20微克总蛋白；样品须溶解）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品活性读数：340波长读数3分钟－340波长读数0分钟

• 计算样品活性

 注意事项

• 本产品为20次操作 
• 本产品检测范围为5至300单位/升
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品须澄清，至关重要 
• 加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定
• 测定值由低到高变化；测定可持续3分钟
• 光谱测定后，比色皿须清洗*
• 样本测定3分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为20微克/50微升（本公司提供    Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 肌酸激酶活性单位浓度定义：在37℃下，pH 6.8的情况下，在单位时间内（每分钟）催化磷酸肌酸转化为肌酸所消耗的酶量
• 本公司提供系列激酶检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感