线粒体呼吸链复合物V活性光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

 MB50083 v.A

 线粒体呼吸链复合物V活性光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 线粒体呼吸链复合物V（F0F1-ATP酶/ATP合成酶）活性光度法定量检测试剂是一种旨在使用丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定与ATP合成对应的ATP水解产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光度法测定样品中酶活性的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种纯化线粒体样品（动物、人体、酵母）以及细胞或组织裂解悬液样品的F0F1-ATP酶/ATP合成酶的特异性活性检测。可用于心肌、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

线粒体呼吸链复合物V，通常称为ATP合成酶（ATP synthase）、F型ATP酶（F type ATPase）和F1F0 ATP酶（F1F0 ATPase），是线粒体氧化磷酸化的*反应。其分子量为500KD，含有十六个亚单位，其中两个：ATP酶6和8为线粒体DNA编码的。ATP酶主要有两个结构域：F0为质子通道，由几个膜蛋白构成，包括a、b、c、d、e、F6、A6L、OSCP（oligomycin sensitive conferring protein）等；和F1催化活性结构域，由水溶性的α3β3γδε蛋白构成。其特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。复合物V的主要功能在于产生大部分细胞所需的能量ATP。ATP的合成需要线粒体内膜电子传递到氧分子时，呼吸链蛋白所产生的质子梯度变化。质子通过F0结构域传递到基质，激活F1催化活性结构域，促使ATP合成。该酶异常会导致心肌和神经系统疾病。基于ATP，在寡霉素参与下，受到F1F0 ATP酶的水解，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），产生的吸光峰值的变化（340nm），来定量分析F1F0 ATP酶活性。其反应系统为：

F1F0 ATPase

 ATP   =    ADP  +  Pi

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate  +  ATP

lactate dehydrogenase

pyruvate  +  NADH       →      lactate  +  NAD⁺

  （高吸收峰） （低吸收峰）

产品内容

 缓冲液（Reagent A）  20毫升

 反应液（Reagent B）      2.5毫升

 阴性液（Reagent C）     2毫升

 底物液（Reagent D） 500微升

 专性液（Reagent E）   250微升

产品说明书      1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融； 反应液（Reagent B），避免光照，有效保证6月

用户自备

比色皿：用于光度分析的容器

分光光度仪：用于光度分析

培养箱：用于孵育反应物

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化； 反应液（Reagent B）注意避光。然后进行下列操作。

• 测定准备

• 准备好待测样品（例如纯化线粒体样品等），置于冰槽里 
• 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔30秒，读数11次（共5分钟），并置零
•  缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取780微升 缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升 反应液（Reagent B）
• 加入20微升 底物液（Reagent D）
• 放进30℃培养箱里孵育3分钟
• 加入100微升 阴性液（Reagent C）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数1分钟或5分钟

• 样品总活性测定

• 移取780微升 缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升 反应液（Reagent B）
• 加入20微升 底物液（Reagent D）
• 放进30℃培养箱里孵育3分钟
• 加入100微升待测样品（注意：10微克总线粒体蛋白）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数1分钟或5分钟

• 样品非特异活性测定

实验开始前，移取100微升待测样品（注意：10微克总线粒体蛋白）到1.5毫升离心管，加入20微升 专性液（Reagent E），混匀后，放进30℃培养箱里孵育15分钟。然后置于冰槽里备用

• 移取760微升 缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升 反应液（Reagent B）
• 加入20微升 底物液（Reagent D）
• 放进30℃培养箱里孵育3分钟
• 加入120微升上述预处理的待测样品
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数1分钟或5分钟

• 计算样品活性

1）样品活性（总活性和非特异活性）

【（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数】÷【0.1（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数 X 1或5（反应时间；分钟）】＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔NADH/分钟

2）样品特异活性

样品总活性－样品非特异活性＝样品特异活性

注意事项

• 本产品为21次操作（10个样本），包括1次背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 线粒体样品检测前，建议冻存融解（－70℃至37℃）循环3次
• 如果增强酶活检测，建议使用 线粒体复合物待测样品预处理试剂盒－GMS10342
• 建议线粒体悬液使用0.25 M SUCROSE和2 mM EDTA，pH9.0；忌用磷酸缓冲溶液
• 建议使用线粒体裂解悬液，而不是细胞裂解悬液。如果使用细胞裂解悬液，*须澄清；第二须加50微克
• 加入样品后3秒内即刻光度测定
• 反应1分钟后光度测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定可以持续5分钟
• 测定值由高到低变化，即0分钟测定读数高于1分钟或5分钟测定读数，表明有酶活性
• 光度测定后，比色皿须清洗*
• 建议待测样本线粒体蛋白浓度为10微克/100微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供 线粒体溶解试剂盒GMS10018为后续的线粒体蛋白浓度测定的预处理试剂盒和  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
• 样品特异活性是指寡霉素敏感的ATP合成酶，去除其它干扰因素（例如复合物I/II/III/IV等）
• 线粒体呼吸链复合物V酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列线粒体及其酶类技术产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测准确