血液血管紧张素Ⅰ转化酶2（ACE2）活性比色法定量检测试剂盒

MB50308.3 v.A

 血液血管紧张素Ⅰ转化酶2（ACE2）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

（中文版）

主要用途

 血液血管紧张素Ⅰ转化酶2（ACE2）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过三肽化合物底物FAPGG，在血管紧张素Ⅰ转化酶1抑制剂的存在下，受到血管紧张素Ⅰ转化酶2的水解，释放出FAP，产生吸收峰值的变化，即采用比色法来测定样品中酶活性的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物和人体血液样品（血浆、血清、红细胞等）血管紧张素Ⅰ转化酶2（ACE2）的特异活性检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，具有高通量、自动化操作的优点。

技术背景

血管紧张素Ⅰ转化酶（angiotensin I-converting enzyme；ACE；EC3.4.15.1），又称为肽基二肽酶A（peptidyl dipeptidase A）、羧基组织蛋白酶（carboxycathepsin）或激肽酶II（kininase II），是一种体细胞类150至180KD、生殖细胞类90至110KD的多肽外切酶（exopeptidase）和锌金属肽酶（zinc metallopeptidase）。血管紧张素Ⅰ转化酶有2种同工酶：1型和2型，其间80至90%同源。I型主要存在于肺毛细管细胞内，也在血管内皮细胞、肾上皮细胞和睾丸leydig细胞膜中表达；II型主要存在于心脏和肾脏血管内皮细胞膜上。ACE在肾素-血管紧张素-醛固酮（aldosterone）系统中发挥重要作用。作为血管收缩剂（vasoconstrictor），ACE催化十肽血管紧张素I的C末端的组胺酰亮氨酸（histidylleucine）二肽的切离水解反应，转化为血管紧张素II；同时作为血管扩张剂（vasodilator），ACE使缓激肽（bradykinin）失活。ACE常用于药物靶标，治疗高血压（例如噻嗪化物thiazide）、心力衰竭（例如利尿灵furosemide）、糖尿病肾病和SARS等疾患。基于人工合成的三肽化合物底物呋喃基丙烯酰苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸（N-[3-(2-furyl)acryloyl]-L-phenylalanylglycylglycine；FAPGG），在血管紧张素Ⅰ转化酶1抑制剂甲羟孕酮醋酸酯（Foroxymithine）的存在下，受到血管紧张素Ⅰ转化酶2的水解，释放出呋喃基丙烯酰苯丙氨酸（furylacryloylphenylalanine；FAP）和双甘氨肽（glycylglycine），产生吸收峰值的变化，在分光光度仪（340nm 波长）下，来定量测定血管紧张素Ⅰ转化酶2的特异活性。血管紧张素Ⅰ转化酶2反应系统为：

产品内容

 清理液（Reagent A） 毫升

 裂解液（Reagent B） 毫升

 缓冲液（Reagent C） 毫升

 阴性液（Reagent D）   毫升

 底物液（Reagent E）   毫升

产品说明书    1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里； 底物液（Reagent E）避免光照和反复冻融；有效保证6月

用户自备

抗凝管：用于血液收集的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

（微型）台式离心机：用于样品操作

培养箱：用于反应物孵育

酶标板或比色皿：用于样品比色测定的容器

酶标仪或分光光度仪：用于样品比色分析

实验步骤

• 样品制备

选择一：血浆样品

• 准备好ACD抗凝管
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层）
• 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
• （选择步骤）移取10微升进行蛋白定量测定 （注意：建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

选择二：血清样品

1． 准备好不含抗凝剂的储存管 

• 抽取1毫升血液，置于储存管里
• 室温下，静置30分钟，直至血液凝结
• 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血清成分（注意：避免触碰白色液体层）
• 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
• （选择步骤）移取10微升进行蛋白定量测定 （注意：建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

选择三：红细胞样品

• 准备好ACD抗凝管
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 转移到15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心30分钟，速度为200g（或1000RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混匀
• 放进4℃台式离心机离心7分钟，速度为1200g（或2500RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心抽去上清液
• 重复实验步骤6至8二次
• 加入xx毫升预冷的 裂解液（Reagent B）
• 涡旋震荡15秒
• 放进4℃台式离心机离心7分钟，速度为1200g（或2500RPM，例如eppendorf 5815）
• 小心移取上清液到新的15毫升离心管
• 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
• （选择步骤）移取10微升进行蛋白定量测定 （注意：建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

• 测定准备

• 准备好药物处理的待测样品
• 设定好酶标仪（温度为37℃）：波长340nm，间隔5分钟，读数6次（共30分钟），并置零或0分钟和30分钟各测读1次，并置零
• 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的 底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照

• 活性测定

• 在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取xx微升 缓冲液（Reagent C）到相应孔中
• 分别加入xx微升 底物液（Reagent E）
• 轻轻摇动96孔酶标板
• 在37℃温度下孵育15分钟
• 分别加入xx微升 阴性液（Reagent D）或上述制备的待测样品（100微克蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动96孔酶标板（限定在10秒之内）
• 即刻放进37℃预热的酶标仪检测或转移到200微升比色皿，在分光光度仪里检测
• 获得吸光读数：0分钟读数－30分钟读数
• 活性计算：

• 酶标仪检测

• 比色皿检测

注意事项

• 本产品为20次操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品须澄清，且避免反复冻融
• 样品避免使用EDTA和EGTA等处理
• 加样后10秒内比色测定
• 测定值由高到低变化；测定持续30分钟
• 比色测定后，比色皿须清洗*
• 样品0分钟读数通常和背景空对照0分钟读数一致，约为1.5左右
• 样本测定30分钟读数低于0分钟读数，即读数下降，表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为100微克/20微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 可以使用血管紧张素Ⅰ转化酶2抑制剂DX600（IC50=10微摩尔）作为抑制剂对照或阴性对照
• 血管紧张素Ⅰ转化酶2单位活性定义为：在37℃，pH 8.3条件下，每分钟内能够产生1微摩尔呋喃基丙烯酰苯丙氨酸（Furylacryloylphenylalanine）所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列血管紧张素Ⅰ转化酶学检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感