标记抗体与Sulfo-NHS-Biotin的比率-西安瑞禧

一般每个抗体可以标记3-5个，标记时，与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10 mg/ml 的抗体溶液来说，应蛋白12倍（摩尔数），对于2 mg/ml 的抗体溶液应20倍，也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

    蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他有自由氨基的添加物。

一、试剂和器材：

1、 标记反应溶液：0.1M  pH 7.2 PBS（0.15M sodium chloride）

NaCl 8.77 g ；Na₂HPO₄·12H₂O 32.3g ；NaH₂PO₄·2H₂O 4.5g；加双蒸水 900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH 7.2，后定容为 1000mL

2、 10mM NHS-dPEG4-Biotin配方：称取0.56mg NHS-dPEG4-Biotin（分子量为587） ，溶解于95 µl 纯水中，临用前配置，不可储存，立刻使用。NHS-PEG4-Biotin容易潮解，开瓶前平衡室温。也可以配置200 nmol/L 储备液：20mg NHS-dPEG4-Biotin 溶解于170µl DMSO中，-20℃稳定几个月。

由于NHS-PEG4-Biotin昂贵，而且使用量少，不能保存，配制时，直接将NHS-PEG4-Biotin放入1.5ml EP管中，以实际称量的NHS-PEG4-Biotin按比率加入纯水。

3、滤管

⑴、Millipore滤管[0.5ml 10KD]:截留分子量10KD，残留体积200µl，蛋白回收率95%，7500×g（允许的大离心力14000×g）离心10min。

⑵、Millipore滤管[0.5ml 50KD]:截留分子量50KD，残留体积80µl，蛋白回收率94%，7500×g（允许的大离心力14000×g）离心5 min。

⑶、Amicon Ultra -0.5ml离心滤管（Millipore），效果好，的终浓缩物体积：5-15ul。

二、抗体滤处理

标记前需要应用截留分子量为50kDa 的滤柱对抗体进行标记前纯化处理(如果不是抗体，一定要按蛋白分子量来确定滤柱截留分子量)，以除去蛋白样品中可能含有的叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他有自由氨基的添加物，防止干扰标记反应。

具体操作步骤：

1、 于滤柱中加入200μl 标记反应溶液，加入500ug 单克隆抗体，混匀。

2、 4℃，6000rpm，离心2min。弃滤液。

3、于滤柱中加入100μl 标记反应溶液，混匀。4℃，Max 14000×g，2min。

4、 重复步骤2 6到7次。

5、 混匀滤柱中的残留的液体，室温静置1min。

6、 将滤柱反转倒置于一的滤管中，4℃，1000×g，2min，收集滤液。

7、 取50μl PBS于滤柱中混匀，静置1min。

8、 倒置滤柱，4℃，6000rpm，2min。收集滤液，与步骤6的滤液合并，4℃放置备用。用标记反应溶液调节抗体浓度到2mg/ml （0.25ml）。

三、标记抗体

1、 计算抗体标记需要用量。 

    抗体浓度 2 mg/ml时的简要计算：

1mL of 2 mg/mL IgG (150,000 MW)需要26 μL of  10mM  NHS-PEG4-Biotin

具体计算方式见附录一（标记计算）

2、 滤后的滤液加入NHS-PEG4-Biotin溶液，室温反应1h。

3、 葡聚糖凝胶分离纯化(去除游离)：

四、葡聚糖凝胶分离纯化标记抗体操作步骤：

   （一）、试剂：

 1、纯化柱处理液 :100 mmol/L Na0H;

 2、纯化柱平衡液: 50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，每升含0.5g NaN₃ ，8g NaCl;

3、样品洗脱液:同纯化柱平衡液;

4、标记抗体保护液（50×）: 10ml0.01M pH7.2 PBS 中加入0.5g BSA，0.2g NaN3。

（二）、凝胶过滤：

    方法见“凝胶过滤法纯化微量标记蛋白”

五、标记抗体的保存方法

    将“标记抗体保护液（50×）”加入到标记抗体溶液中，使BSA终浓度为0.1%，4 ℃ 或-20 ℃ 保存。

六、数据记录：

抗体浓度：    mg/ml        加入抗体体积：    µl

标记前抗体体积：   µl      加入NHS-PEG4-Biotin体积：    µl

纯化柱规格：  cm ×   cm   凝胶体积：     ml

加入标记抗体体积：   µl        

洗脱溶液 1ml/管收集，到核酸蛋白检测仪显示出峰后，改为0.5ml/管收集，并记录数据：

附录：

一、标记计算：

   1、不同抗体浓度时，抗体与Sulfo-NHS-Biotin的比率：

     Sulfo-NHS-Biotin MW：589

  2、10mmol/L Sulfo-NHS-Biotin 配方：

3、标记计算加入体积计算：

西安瑞禧生物可以提供的定制材料包括有：

UV-Tracer Biotin NHS Ester

Biotin-EA -乙二胺

Biotinyl hexylamine

Biotin-PFP 五氟苯酯

Biotin-LC-NHS N-琥珀酰亚氨基6-氨己酸

Biotin-LC; 6-氨基己酸

4-((Biotinoyl)amino)Butyric acid 酰基-4-氨基丁酸

Biotin-HZ 酰肼

LC-(+)-Biotin hydrazide CAS:109276-34-8

Biotin-HPDP cas:129179-83-5

D-Biotinol; D-醇 CAS：53906-36-8

BIOTIN DSHSE CAS:142439-92-7

Biotinyl Cystamine -半胱胺 cas:128915-82-2

Biotin-Dadps-azide

Dethiobiotin  533-48-2

Desthiobiotin NHS Ester  CAS:80750-24-9

Biotin-ONP (+)--4-硝基苯酯 33755-53-2

Biotin-L-sulfoxid；亚砜 3376-83-8

Biotin-cadaverin trifluoracetate   288259-39-2

N-Biotinyl Glycine;甘氨酸  160390-90-9

D-甲酯;DL-Biotin methyl ester  60562-11-0

Biotin修饰CdTe量子点

化修饰的聚己内酯(PCL/Biotin)

Biotin-PEG-b-Leu

链霉亲和素化的量子点(streptavidin-QDs)

Prazosin-PEG2000-biotin

(Biotin)表面功能化修饰多壁碳纳米管

Biotin-PEG-PLL-peptide-DOX

PLL-PEG-Biotin

Biotin-PEG-c(RGDyK)

biotin-HWTX-Ⅰ标记蛛神经虎纹捕鸟蛛-Ⅰ

ssDNA-Biotin-SA-AuNPs复合物

标记的透明质酸(HA-biotin

PAH-Biotin修饰半胱氨酸

Biotin-Ebselen小分子探针

偶联四氨基卟啉

磷酰化偶联壳聚糖

Chol-Dex-Biotin 偶联葡聚糖修饰

DOTA-Biotin偶联大环配体造影

藻胆蛋白标记Phycobiliprotein-Biotin

藻胆蛋白-链霉亲和素(Streptavidin-phycobiliprotein)

偶联物OVA-ZEN-biotin

(Biotin)偶联的多肽zs6

Biotin-DNA偶联物

鸡卵清白蛋白偶联(Biotin-OVA)

辅A-(Coenzyme A-biotin)

FITC标记的转铁蛋白(Tf-FITC)

(biotin)修饰的ddNTP核苷酸

活化的转铁蛋白(Biotin-Tf)

HEMA-biotin-Lys-CD

蛤蚌-偶联物

姜黄素-偶联物

多肽CRGD修饰红膜

偶联胆甾醇化乙二醇壳聚糖

-葡聚糖聚醛偶联物(Chol-Dex-CHO)

BIO修饰阿霉素DOX-biotin

修饰BIOTIN-Drud

CY3/CY5/CY5.5-Biotin修饰荧光染料

Biotin alkyne  773888-45-2

Biotin-PEG4-alkyne  1458576-00-5

Biotin-PEG2-C4-alkyne  1011268-28-2

Biotin-PEG4-amide-Alkyne  1006592-45-5

Dde Biotin-PEG4-alkyne  1802908-00-4

PC Biotin-PEG3-alkyne  1869922-24-6

Diazo Biotin-PEG3-alkyne  1884349-58-9

DADPS Biotin Alykne  

Biotin-PEG2-azide  1910803-72-3

Biotin-PEG3-azide  875770-34-6

Biotin-PEG4-azide  1309649-57-7

Biotin-PEG2-C6-azide  1011268-29-3

Biotin-PEG4-Picolyl azide  2222687-71-8

Biotin-SS-azide  1620523-64-9

Dde Biotin-PEG4-azide  1802907-93-2

Dde Biotin-PEG4-Picolyl azide  2055048-42-3

Diazo Biotin-PEG3-azide  1339202-33-3

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