组织甘油激酶（Glycerol kinase）活性酶连续反应光谱法定量

MB50379.2 v.A

 组织甘油激酶（Glycerol kinase）活性酶连续反应光谱法定量检测试剂盒

产品说明书（中文版）

主要用途

 组织甘油激酶（Glycerol kinase）活性酶连续反应光谱法定量检测试剂是一种旨在使用甘油激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光谱法测定样品中酶活性的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种动物、人体组织裂解悬液样品的甘油激酶的性活性检测。可用于脂类代谢、能量代谢、蛋白组学、病理生理学等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

甘油激酶（glycerol kinase；GK；EC2.7.1.30），又称为ATP甘油-3-磷酸转移酶（ATP:glycerol 3-phospho transferase），广泛存在于生物界。甘油激酶催化由ATP提供的磷酸基团，转移到甘油分子上的反应，产生磷酸甘油。哺乳动物中，甘油激酶参与糖和脂类代谢的交接部位的反应；微生物中，甘油激酶帮助利用甘油分子，作为微生物生长所需的碳源。临床上常用于定量检测人体内甘油水平。通常脂肪细胞（adipocyte）缺乏甘油激酶，由甘油三酯降解产生的甘油分子，由血液转运到肝脏后，甘油激酶参与脂类分解（lipolysis）。基于底物甘油分子，在ATP的参与下，受到甘油激酶的磷酸化，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），产生的吸光峰值的变化（340nm），来定量分析甘油激酶活性。其反应系统为：

glycerol kinase

Glycerol  +  ATP   →    ADP  +  α-glycerophosphate

pyruvate kinase

Phosphoenolpyruvate  +  ADP       →      pyruvate  +  ATP

lactate dehydrogenase

pyruvate  +  NADH       →      lactate  +  NAD⁺

  （高吸收峰） （低吸收峰）

产品内容

 清理液（Reagent A）  60毫升

 裂解液（Reagent B）  10毫升

 缓冲液（Reagent C）  20毫升

 反应液（Reagent D）      2.5毫升

 阴性液（Reagent E）     2毫升

 底物液（Reagent F） 500微升

产品说明书      1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融； 反应液（Reagent D），避免光照，有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

（微型）台式离心机：用于样品操作

比色皿：用于光谱分析的容器

分光光度仪：用于光谱分析

培养箱：用于孵育反应物

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化； 反应液（Reagent D）注意避光。然后进行下列操作。

• 样品准备

• 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量 
• （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入3毫升 清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一个液氮冻存管
• 即刻放进液氮罐过夜
• 次日从液氮罐里取出，即刻（*速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
• 放进一个15毫升锥形离心管
• 加入预冷的500微升 裂解液（Reagent B） 
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 强力涡旋震荡30秒，充分混匀
• 置于冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－ MB30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备

• 准备好待测样品，置于冰槽里 
• 设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数11次（共10分钟），并置零
•  缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取780微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升 反应液（Reagent D）
• 加入20微升 底物液（Reagent F）
• 放进25℃培养箱里孵育3分钟
• 加入100微升 阴性液（Reagent E）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数10分钟

• 样品活性测定

• 移取780微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升 反应液（Reagent D）
• 加入20微升 底物液（Reagent F）
• 放进25℃培养箱里孵育3分钟
• 加入100微升待测样品（注意：100微克总蛋白）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数10分钟

• 计算样品活性

【（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数】÷【0.1（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数 X 10（反应时间；分钟）】＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔NADH/分钟

• 酶标板测定

• 在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取195微升 缓冲液（Reagent C）到96孔板中的所有孔中
• 分别加入25微升 反应液（Reagent D）
• 分别加入5微升 底物液（Reagent F）
• 轻轻摇动96孔酶标板
• 在25℃温度下孵育3分钟
• 分别加入25微升 阴性液（Reagent E）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动酶标板
• 即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数
• 活性计算

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.25（体系容量；毫升）]÷[0.025（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 10（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔NADH/分钟

注意事项

• 本产品为21次操作，包括1次背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 避免使用磷酸缓冲溶液处理样品
• 加入样品后3秒内即刻光谱测定
• 初始反应可能较为迟缓；测定值由高到低变化；测定可以持续10分钟
• 测定值由高到低变化，即0分钟测定读数高于10分钟测定读数，表明有酶活性
• 光谱测定后，比色皿须清洗*
• 建议待测样本蛋白浓度为100微克/100微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒 MB30030.1）
• 甘油激酶活性单位定义：在25℃温度下，pH 8.9条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列激酶类技术产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测准确