细胞脊髓过氧化酶（MPO）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

MB50018.1.1 v.A

 细胞脊髓过氧化酶（MPO）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 细胞脊髓过氧化酶（MPO）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过脊髓过氧化酶反应系统中底物还原性愈创木酚，经过过氧化反应后，产生的吸光值变化，即采用比色法来测定细胞样品中酶活性的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物或人体细胞裂解萃取样品脊髓过氧化酶（MPO）的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

脊髓过氧化酶（myeloperoxidase；MPO；EC1.11.1.7）是一种高度阳离子糖基化血红素蛋白（hemeprotein），由两个双体通过二硫键连接在一起。每个双体由一个重链亚体（53kd）和一个轻链亚体（15kd）构成。其总分子量为144kd。脊髓过氧化酶存在于多形核白细胞的嗜天青颗粒（azurophilic granule）中，尤其在中性白细胞和单核细胞中。脊髓过氧化酶通过使用过氧化氢，氧化芳香类化合物，产生自由基，达到抗菌作用。脊髓过氧化酶可以催化氯离子的过氧化作用，生成非自由基次绿酸（hypochlorite）。脊髓过氧化酶参与机体的天然防御机制，但是一旦失控，则会产生组织损害和炎症反应。脊髓过氧化酶的活性检测可以用来评价和诊断心血管疾病状况。基于底物还原性愈创木酚（guaiacol或2-o-methoxyphenol），作为氢的供体，在过氧化氢的参与下，受到脊髓过氧化酶的过氧化催化，成为氧化性愈创木酚，而发生吸光值的增高（470nm波长），来定量测定脊髓过氧化酶的活性。脊髓过氧化酶反应系统为：

myeloperoxidase

2 （reduced guaiacol） +  H2O2       →      2 （oxidized guaiacol）  +  2H2O

产品内容

 清理液（Reagent A） 120毫升

 裂解液（Reagent B）  10毫升

 缓冲液（Reagent C）  20毫升

 底物液（Reagent D）   1毫升

 氧化液（Reagent E）   1毫升

 阴性液（Reagent F）   500微升

产品说明书      1份

保存方式

保存 裂解液（Reagent B）和 底物液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 底物液（Reagent D）避免光照，有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于反应液配制以及样品制备和保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

细胞刮脱棒：用于细胞脱离

微型台式离心机：用于样品制备

培养箱：用于孵育反应物

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

• 样品准备 

• 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）
• 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），覆盖生长表面
• 小心抽去清理液
• 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升 清理液（Reagent A），混匀细胞
• 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 裂解液（Reagent B），充分混匀
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于冰槽里孵育30分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1；同时使用 裂解液（Reagent B）作为空白对照）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测定准备

• 准备好上述待测样品，置于冰槽里
• 设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长470nm，并置零  
• 测读开始前，移取100微升 底物液（Reagent D）到新的1.5毫升离心管，加入100微升 氧化液（Reagent E），轻柔混匀后，标记为 反应工作液，放在暗室里
•  缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取800微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升含有 底物液（Reagent D）和 氧化液（Reagent E）的 反应工作液
• 加入100微升 阴性液（Reagent F）
• 上下倾倒数次，混匀
• 放进25℃培养箱里孵育5分钟
• 即刻放入分光光度仪检测，此为背景空对照 

• 样品测定

• 移取800微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升含有 底物液（Reagent D）和 氧化液（Reagent E）的 反应工作液
• 加入100微升上述准备的样品（100微克蛋白总量）
• 上下倾倒数次，混匀 
• 放进25℃培养箱里孵育5分钟
• 即刻放入分光光度仪检测，此为样品读数 

• 计算样品活性

[（样品读数－背景读数）X 1.0（体系容量；毫升）X 样品稀释倍数]÷[0.1（样品容量；毫升）X 26.6（毫摩尔吸光系数）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔愈创木酚/分钟

• 酶标仪测定

• 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取200微升 缓冲液（Reagent C）到96孔板里
• 分别加入25微升含有 底物液（Reagent D）和 氧化液（Reagent E）的 反应工作液
• 分别加入25微升 阴性液（Reagent F）或待测样品（50微克蛋白总量）到相应孔里
• 轻轻摇动96孔板
• 放进25℃培养箱里孵育5分钟
• 即刻放进酶标仪检测：获得背景和样品读数
• 活性计算：

[（样品读数－背景读数）X 0.25（体系容量；毫升）X 样品稀释倍数]÷[0.025（样品容量；毫升）X 26.6（毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 5（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（稀释后样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔愈创木酚/分钟

注意事项

• 本产品为20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品须澄清，至关重要 
• 比色测定后，比色皿须清洗*
• 样本测定吸光值读数越高，表明酶活性越高
• 反应测定值随着时间增加，吸光读数逐渐增高；如果酶活过低，反应孵育可以持续10至20分钟，甚至60分钟
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品容量
• 脊髓过氧化酶单位活性定义为：在25℃，pH 7.0条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔愈创木酚所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列氧化酶类分析技术产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感