1 原理及用途

    本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测水产组织、畜禽组织、肝脏、蛋类、蜂蜜、牛奶及饲料等样品中的氯霉素药物（Chloramphenicol，Cap），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的氯霉素药物和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗氯霉素药物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含氯霉素药物含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中氯霉素药物的残留量。、

2 技术指标

2.1 试剂盒灵敏度：0.05ppb

2.2 反应模式：25℃，30min～30min～15min。

2.3 样本检测下限：

蛋类、牛奶（方法一）……………………0.1ppb

尿液、血清、肠衣、饲料、奶粉………0.05ppb

组织、肝脏、蜂蜜、牛奶（方法二）……0.025ppb

2.4 交叉反应率：

氯霉素 ………………………………………100%

甲砜霉素……………………………………＜0.1%

氟甲砜霉素…………………………………＜0.1%

2.5 样本回收率：

组织、肝脏…………………………………85%±20%

蜂蜜、肠衣…………………………………85%±25%

牛奶、饲料…………………………………75%±25%

尿液、血清…………………………………70%±20%

3 试剂盒组成

酶标板………………………………………96孔

标准品（绿盖）：各1ml

0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

高标准品（红盖）：100ppb…………………1ml

酶标记物(红盖)………………………………11ml

抗体工作液(蓝盖)……………………………5.5ml

底物液A(白盖)………………………………6ml

底物液B(黑盖)………………………………6ml

终止液(黄盖)…………………………………6ml

20X浓缩洗涤液(白盖)……………………40 ml

2X复溶液(黄盖)………………………………50 ml

说明书 …………………………………………1份

4 需要的器材和试剂

4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 试剂：乙酸乙酯、正己烷、乙腈、醋酸钠、醋酸

、亚硝基铁（K2Fe(CN)5(NO)▪2H2O）、葡萄糖苷酸酶、硫酸锌（ZnSO4·7H2O）

5 样本前处理

5.1 样本处理前须知：

    实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。

5.2 配液：

配液1：0.36M亚硝基铁溶液（牛奶、奶粉样本）

11.9g亚硝基铁加去离子水至100ml溶解。

配液2：1.04M硫酸锌溶液（牛奶、奶粉样本）

    29.8g硫酸锌加去离子水至100ml溶解。

配液3：0.1M pH4.8醋酸钠缓冲液（尿液样本）

    2.4g醋酸钠加去离子水500ml溶解，加1.2ml醋酸混匀。

配液4：乙腈-水溶液

    V乙腈:V水=84:16

配液5：样本复溶液

    2×复溶液在使用前按1:1用去离子水稀释，用于样本提取后的复溶。

5.3 样本前处理步骤：

5.3.1 组织、肝脏样本处理方法

1）称取均质后的样本3±0.05g于50ml离心管中，先加入3ml去离子水振荡混匀，再加入6ml乙酸乙酯振荡2分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取上层液体4ml在50-60℃下氮气吹干；

3）加入用1ml正己烷溶解干燥的残渣，再加入1ml样本复溶液混合30秒，室温4000转/分离心5分钟；

4）去除上层有机相相，取下层水相50μl进行分析。

    样本稀释倍数：0.5倍

5.3.2 血清、血浆样本处理方法

1）取1ml血清或血浆至离心管中，加入2ml乙酸乙酯振荡1分钟，室温4000转/分离心5分钟，或静置使水相与有机相分离；

2）取全部上层液体在50-60℃下氮气吹干；

3）用1ml样本复溶液溶解干燥的残渣，混合30秒，室温4000转/分离心5分钟；

4）去除上层有机相相，取下层水相50μl进行分析。

    样本稀释倍数：1倍

5.3.3 尿液样本处理方法

1）取2ml尿液至离心管中，加入0.1M pH4.8醋酸钠缓冲液0.5ml混合，加40ul葡萄糖苷酸酶，混匀，37℃水解2小时以上（或过夜）；

2）将上述溶液恢复至室温后加入8ml乙酸乙酯振荡1分钟，室温4000转/分离心10分钟，取4ml上层液体在50-60℃下氮气吹干；

3）用1ml样本复溶液溶解干燥的残渣，混合30秒；

4）取50μl进行分析。 

    样本稀释倍数：1倍

5.3.4 蜂蜜样本处理方法

1）取2±0.05g蜂蜜于离心管中，用4ml去离子水溶解，加入4ml乙酸乙酯振荡2分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取上层液体2ml在50-60℃下氮气吹干；

3）用0.5ml样本复溶液溶解干燥的残渣，混合30秒；

4）取50μl进行分析。

样本稀释倍数：0.5倍

（检测下限0.025ppb，定量下限0.1ppb，因某些样本有干扰建议以0.1ppb作为阳性判定值）

5.3.5 肠衣样本处理方法

1）肠衣经清洗后均质，称取均质后的样本1±0.05g于50ml离心管中，加入10ml乙酸乙酯振荡2分钟，室温4000转/分离心10分钟；

2）取上层液体5ml在50-60℃下氮气吹干；

3）用1ml正己烷溶解干燥的残渣，再加入0.5ml样本复溶液溶振荡混合30秒，室温4000转/分离心5分钟；

4）去除上层有机相相，取下层水相50μl进行分析。

    样本稀释倍数：1倍

5.3.6 牛奶样本处理方法一

1）将牛奶样本15℃4000转/分离心10分钟，去除上层脂肪，取5ml去脂肪奶样于50ml离心管中，加150ul 亚硝基铁溶液（配液1）振荡混合30秒，加150ul 硫酸锌溶液（配液2）振荡混合30秒，15℃4000转/分离心10分钟；

2）取上层液体加等量样本复溶液溶振荡混合30秒，

3）取50μl进行分析。

    样本稀释倍数：2倍（检测下限0.1ppb，定量下限0.15ppb）

5.3.7 牛奶样本处理方法二

1）将牛奶样本15℃4000转/分离心10分钟，去除上层脂肪，取5ml去脂肪奶样于50ml离心管中，加250ul 亚硝基铁溶液（配液1）振荡混合30秒，加250ul 硫酸锌溶液（配液2）振荡混合30秒，15℃4000转/分离心10分钟；

2）取上层液体2.2ml（相当于2ml鲜奶）于另一离心管中，加入4ml乙酸乙酯振荡2分钟，室温4000转/分离心10分钟；

3）取上层液体2ml在50-60℃下氮气吹干；

4）用0.5ml样本复溶液溶溶解干燥的残渣，混合30秒；

5）取50μl进行分析。

    样本稀释倍数：0.5倍（检测下限0.025ppb，定量下限0.05ppb，因某些样本有干扰建议以0.15ppb作为阳性判定值）

5.3.8 奶粉样本处理方法

1）取2±0.05g奶粉于50ml离心管中，用10ml去离子水溶解，加入1ml 亚硝基铁溶液（配液1）和1ml 硫酸锌溶液（配液2）振荡混合，15℃4000转/分离心10分钟；

2）取上层液体3.6ml（相当于0.6g奶粉）于另一离心管中，加入6ml乙酸乙酯振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟；

3）取上层液体4ml在50-60℃下氮气吹干；

4）用0.4ml样本复溶液溶溶解干燥的残渣，混合30秒；

5）取50μl进行分析。

样本稀释倍数：1倍（检测下限0.05ppb，定量下限0.15ppb，因某些样本有干扰建议以0.15ppb作为阳性判定值）

 5.3.9 蛋类样本处理方法

1）取3±0.05g均质的蛋类样本于50ml离心管中，加9ml乙腈-水溶液振荡混合2分钟，15℃4000转/分离心10分钟；

2）取上层液体3ml于另一离心管中，加入3ml去离子水，再加4.5ml乙酸乙酯振荡1分钟，5℃4000转/分离心10分钟；

3）取全部上层液体在50-60℃下氮气吹干；

4）用1ml正己烷溶解干燥的残渣，再加入2ml样本复溶液溶振荡混合30秒，室温4000转/分离心5分钟；

4）去除上层有机相相，取下层水相50μl进行分析。

    样本稀释倍数：2倍（检测下限0.1ppb，定量下限0.3ppb）

5.3.10 饲料样本处理方法

1）取2±0.05g均质的饲料于50ml离心管中，用2ml去离子水溶解，再加入6ml乙酸乙酯振荡2分钟，15℃4000转/分离心10分钟；

2）取上层液体3ml载50-60℃下氮气吹干；

3）用1ml正己烷溶解干燥的残渣，再加入1ml样本复溶液溶振荡混合30秒，室温4000转/分离心5分钟；

4）去除上层有机相相，取下层水相50μl进行分析。

    样本稀释倍数：1倍

6 酶联免疫实验步骤

将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

实验开始前需：

将20×浓缩洗涤液用去离子水按1:19稀释成工作洗涤液。

6.1 编    号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

6.2 加样反应：加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体工作液50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光反应30分钟。

6.3 洗    涤：将孔内液体甩干，用工作洗涤液250µl/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，后用吸水纸拍干。

6.4 加酶反应：加酶标记物100µl/孔，25℃避光反应30分钟。

6.5 洗    涤：同上

6.6 显    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟。

6.7 终    止：加终止液50µl/孔，轻轻振荡混匀，终止反应。

6.8 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。

7 结果分析

7.1 百分吸光率的计算

    标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以个标准（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A：标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

A0：0ppb标准溶液的平均吸光度值

7.2 标准曲线的绘制与计算

    以标准品百分吸光率为纵坐标，对应的标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准品的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。

    若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（咨询索取）

8 注意事项

8.1 室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

8.3 混合要均匀，洗板要*，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。

8.5 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度的降低。不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8.7 反应终止液具有腐蚀性，如不慎接触皮肤或衣物请立即用大量自来水冲洗。

9 贮藏及保存期

储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，不要冷冻。

保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒

——寻梦环游记

如果说世上除了死亡，还有什么会把人分隔在两个世界，我想答案应该是阿尔兹海默病（AD）。这个疾病大家一定不会觉得陌生，在许多影视剧、公益广告和小说作品里都有它的身影，比如都挺好里的苏大强，综艺节目《忘不了餐厅》，电影《依然爱丽丝》……在我们为难能可贵的亲情感动之余，对阿尔兹海默病的了解也加深了。

即便如此，不了解甚至歧视这种病的大有人在。为了提高人们对AD的认识，阿尔茨海默病协会（ADI）以每年的9月作为世界阿尔茨海默病月，并将每年的9月21日定为世界阿尔茨海默病日。今年活动月的主题为“Let’s talk about dementia”。号召全社会能够从内心去改变，积极地关注患病的人而不是病，给患者及家庭以尊重、以力量，使他们面对困境不再回避，面对疾病更加从容。

阿尔兹海默病概述

AD是一种进行性和不可逆的神经退行性疾病，大概占所有痴呆病例的60％~80％。记忆力减退是AD见的症状。一开始，遗忘可能是微妙的，但随着时间的推移，记忆的丧失会恶化，直到它干扰日常生活。即使在熟悉的环境中，患有AD的人也可能迷路或迷茫。受影响的人越来越需要穿衣，吃饭和个人护理方面的帮助。

随着疾病的进展，一些患有阿尔茨海默病的人会经历个性和行为的改变，并且难以以适合社交生活。其他常见症状包括躁动、烦躁不安和语言能力丧失等。随着老龄化进程的加快，罹患阿尔茨海默症的人数也在逐年增长。据统计，2018年有5000万左右的人患有AD， 预测到2050年患病总人数将超过1.3亿人。由于受影响的人数以及疾病的缓慢和可怕的过程，AD造成了很高的经济和社会负担。预计到2030年，经济负担将增加到2万亿美元。遗憾的是，目前还没有治疗AD的有效方法。

阿尔茨海默病的发病机制

AD的病因尚未明确，科学家们提出了很多假说，目前*的病因是脑内的老年斑和神经原纤维缠结的积聚，老年斑由β-淀粉样蛋白（Aβ）构成，神经原纤维缠结，则由tau蛋白异常磷酸化导致。

图1. 根据淀粉样蛋白假说，在AD出现临床症状前数十年，病理变化已经悄然发生

通常，两种蛋白质聚集体的形成始于海马体并影响与基底前脑、丘脑和下丘脑相互作用的细胞，这是形成记忆所必需的结构。随着蛋白质的扩散，神经元会死亡，脑组织的总体积也会减少。已经证明，与健康成人对比，由于脑组织大小减少，可以根据脑部扫描识别患有轻度认知障碍或晚期AD的患者。

图2. 健康成人与AD患者脑组织对比及AD典型的病理变化

并不是所有人都支持由此衍生的两大假说，关于AD的发病机制，研究人员还提出了别的假说。比如：炎症被认为是一个重要原因。在阿尔茨海默病的后期阶段，大脑的免疫细胞（称为小胶质细胞）进入超速状态，杀死神经元。一些研究人员认为这是导致痴呆大多数症状的原因，这意味着炎症可能是一个有价值的方向；一些研究人员认为，某些感染可引起阿尔茨海默病，这表明抗菌药物或抗病物可能具有治疗价值。Ruth Itzhaki于1997年发表的一项研究表明，HSV感染和APOEε4基因变异的组合赋予了AD很大的发病风险。2016年，Itzhaki和几位同事在“阿尔茨海默病杂志”上发表了一篇社论，声称微生物在阿尔茨海默病中的作用被忽视，需要进行更多的研究，包括抗菌药物的试验。此外，很多研究者也将目光投向基因检测，例如，有研究将上万个AD患者的DNA信息与其他没有患病的老年人进行比较，从而筛选出可能与AD发病相关的基因；一些研究通过外显子测序发现一些与AD相关的突变位点，然后通过基因敲除、点突变或基因敲除动物模型进一步验证这些新基因或新突变是否是会导致AD发病。

阿尔兹海默症的治疗和药物研发

他克林是一种获FDA批准用于治疗AD相关记忆丧失和认知障碍的药物。从那时起，市场上又引入了四种药物，目前用于治疗AD的认知问题。其中三种药物是乙酰胆碱酯酶抑制剂 ，它们是卡巴拉汀，加兰他敏和多奈哌齐。另一种药物美金刚 ， 是一种NMDA受体激动剂。这些药物通过保持思维，记忆或说话技巧，帮助个人开展日常活动。他们还可以帮助解决与AD相关的一些行为和个性变化。 但是，它们都不能逆转、停止甚至减缓病情的发展。

随着研究人员对AD的了解越来越多，人们越来越意识到有效治疗需要针对多种因素，包括遗传、免疫系统和生活方式，早期干预可能是成功治疗的关键。

阿尔兹海默症的危险因素

基因：大约1％的AD病例是由基因APP，PSEN1或PSEN2的突变引起的，这些突变影响β-淀粉样蛋白的加工。 APOE和TREM2中的某些突变可以增加发生散发性阿尔兹海默症的风险。

性别：女性阿尔茨海默病的总发病率是男性的两倍。这种差异不能用女性有着更长的预期寿命来解释，但荷尔蒙和生活方式可能起到一定的作用。

生活方式：这些包括糖尿病、肥胖、抑郁、吸烟和教育程度低。

阿尔茨海默症体内研究的动物模型

1995年，诞生了 一个具有AD样神经病变的转基因小鼠—PDAPP小鼠，在大脑中表达高水平的人突变APP，并且能发展出AD包括斑块和认知缺陷的许多标志。从那时起，许多啮齿动物模型已被开发用于研究AD。

表达人类APP突变体(K670N/M671L、V717I、V717F和D23N系)， PSEN1(PS1系)和PSEN2(PS2系)突变体的小鼠均表现出渐进的、早发型的痴呆症状，但都缺乏神经元纤维缠结的形成。目前，已有成熟的双转基因APP/PS小鼠和三转基因3×Tg小鼠系(包含人类APP、PS1突变和Tau突变)模型用于AD研究。5×FAD小鼠系是结合三个人类APP突变体和两个PS1突变建立起来的，该小鼠模型更早地出现淀粉样病变、认知障碍及神经元损失。这些多转基因小鼠较单转基因小鼠的病理表现与阿尔兹海默症更相似，具有更高的应用前景。不过这些模型难以评估一些新发现的基因突变是否对AD的发生发展有影响。

虽然目前研究AD的动物模型有其局限性，但它们各有特点，对于推进AD的治疗和研究至关重要。由于不同的模型可能会得到不同的结果，许多研究人员在他们的研究中使用多种AD模型或者将基因编辑鼠和其它方法结合产生复合模型来更好地研究AD。

几十年来，β-淀粉样蛋白（Aβ）一直主导着AD的研究—这也许是以牺牲其他有价值的想法为代价。随着近年来以淀粉样蛋白假说为基础的多种药物在临床试验中不断“战败沙场”，一些研究人员认为现在是探索替代途径的时候了。阿尔兹海默症的研究，任重而道远，希望科学家们和药企早日攻破难关，为患者及亲属带来希望的曙光。

赛业生物历经13年发展，已服务数万名科学家，产品和技术已直接应用于包括CNS（Cell，Nature, Science）三大期刊在内的3000余篇学术论文。除了提供基因敲除、基因敲入、条件性基因敲除模型定制服务外，赛业生物还有专业的手术疾病模型团队，可以提供多种复杂精细的小鼠手术模型，包括心脏缺血再灌注模型、急性心肌梗死诱导的慢性心衰模型、主动脉缩窄模型（TAC）、肺动脉高压模型与血流动力学测试、急性肾衰模型（AKI）、大脑中动脉栓塞/中风模型（MCAO）、出血性脑卒中模型（CIH模型）等等。赛业生物都可为您定制AD动物模型，包括基因突变、基因敲除、人源化小鼠等模型，助力您的研究取得突破性进展。如有需要，欢迎联系我们咨询