精子细胞氧化应激活性氧（ROS）细胞流式仪检测试剂盒

精子细胞氧化应激活性氧（ROS）细胞流式仪检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 精子细胞氧化应激活性氧（ROS）细胞流式仪检测试剂是一种旨在使用透膜荧光染色剂二氯荧光乙酰乙酸盐，在细胞氧化条件下，产生荧光，来定量检测精子细胞内活性氧族的生成和增加的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于动物和人体精子细胞的活性氧族的检测。可以被用于细胞凋亡、衰老、代谢和营养学，以及发育生物学（男性不育）等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简便，性能稳定，荧光清晰。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，甚而导致诸如男性不育、冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。2',7'-二氯荧光乙酰乙酸盐（2',7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）一种*自由通过细胞膜的染色剂。一旦被过氧化氢、过氧化基、过氧亚硝基阴离子等氧化，便产生荧光。据此测定精子细胞内活性氧族的浓度。 

产品内容

 高纯液（Reagent A）    毫升

 低纯液（Reagent B）    毫升

 保存液（Reagent C）    毫升

 染色液A（Reagent D）    微升

 染色液B（Reagent E）    微升

产品说明书   1份

保存方式

保存 高纯液（Reagent A）和 低纯液（Reagent B）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里； 染色液A和B（Reagent D和E）避免光照，有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

2毫升离心管：用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

细胞培养箱：用于样品孵育

微型台式离心机：用于样品操作

血细胞计数器：用于细胞计数

细胞流式仪：用于分析染色的精子细胞

实验步骤

• 样品预处理

• 移取2毫升新鲜收集（48小时内）的精液到2毫升离心管
• 放进37℃培养箱孵育20分钟（注意：可以离心后加入 保存液（Reagent C）后，直接染色检测）——此为纯精液精子细胞
• 准备一个15毫升锥形离心管
• 加入xx毫升 高纯液（Reagent A）
• 小心加入xx毫升 低纯液（Reagent B）在上述 高纯液（Reagent A）的上面（注意：避免震荡）
• 小心加入xx毫升精液在上述 低纯液（Reagent B）的上面（注意：避免震荡）
• 放进台式离心机离心20分钟，速度为300g
• 小心移取 高纯液（Reagent A）和 低纯液（Reagent B）交界面上的精子细胞——此为不成熟精子细胞（注意：如果检测不成熟精子细胞，可以加入 保存液（Reagent C）保留）
• 小心移取管底精子细胞颗粒群到新的1.5毫升离心管——此为成熟精子细胞
• 加入xx毫升 保存液（Reagent C），混匀成熟精子细胞颗粒群
• 充分混匀后，在血细胞计数器上进行精子细胞计数
• 调整精子细胞数为1 X 10⁶/毫升
• 放进37℃培养箱里备用（1小时内）

• 细胞流式仪分析

• 加入xx微升 染色液A（Reagent D）到上述制备的500微升1 X 10⁶/毫升的精子细胞，混匀
• 加入xx微升 染色液B（Reagent E）到上述制备的500微升1 X 10⁶/毫升的精子细胞，混匀
• 室温（25℃）下孵育40分钟，避免光照
• （选择步骤）放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或1000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• （选择步骤）小心抽去上清液
• （选择步骤）加入xx毫升 保存液（Reagent C），混匀颗粒群
• 即刻进行细胞流式仪双通道分析：观察至少10000个精子细胞以上

• 细胞流式仪检测纯精液样品精子细胞氧化应激活性氧参考图像如下

注意事项

• 本产品为20次（500微升体系）操作
• 操作时须戴手套
• 用户根据需要进行纯精液精子细胞、不成熟或成熟精子细胞的检测分析
• 如果纯精液样品中含有1 X 10⁶白细胞/毫升，不宜进行纯精液精子细胞活性氧检测
• 样品检测前，建议在血细胞计数器上进行精子细胞计数
• 精子细胞计数时乘上稀释倍数10⁴。标准血细胞计数器（Hemocytometer）的计算方法是：

1毫米方块的细胞计数X 10⁴（稀释倍数）＝实际细胞数/毫升

• 染色完成后，即刻进行检测分析，否则影响检测
• 使用向前散射光（forward angle light scatter）选择性排除精子细胞残渣和精子细胞集聚颗粒
• 建议使用100精子细胞/秒流速为佳
• 本产品也可用于冻存精子细胞的检测分析
• 正常纯精液样品的精子细胞活性氧阳性率较低，通常为小于4%
• 本公司提供系列发育生物学相关检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定荧光清晰