神经突触体（synaptosome）高纯分离试剂盒产品说明书（中文版）

神经突触体（synaptosome）高纯分离试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 神经突触体（synaptosome）高纯分离试剂是一种旨在从动物神经细胞或组织中分离出完整而高度纯化的突触体细胞器的*而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于动物脑组织（包括脑皮质、纹状体、海马等）和培养神经细胞的活性突触体的高纯制备。其制备物产量高，可以被用于神经传导介质、信号传递、蛋白组学和神经性疾病的病理生理学等的研究。产品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能稳定，分离产量和纯度俱佳。

技术背景

突触体（synaptosome），又称为纯化的神经末端（nerve terminals），源自于神经轴突（axons）和突触后连接（postsynaptic connections），内含有细胞浆、突触囊泡（synaptic vesicle；SV）、突触后致密区（postsynaptic density；PSD）、线粒体和细胞骨架等结构，其具有生产ATP，具备功能性离子通道、载体和受体，维持膜电位和离子内平衡、摄取和释放神经传导介质（neurotransmitters），胞饮（endosytosis）等功能。突触体成为脑组织中突触功能分子机制研究的模型系统，以提供足够的蛋白生化材料，识别主要的神经传导介质及其代谢活性、摄取和释放机制，发现突触传导调节信号通路，包括学习、记忆、感觉整合、运动调度和情绪反应等，研究突触功能异常与衰老和神经性疾病的相关性。突触体细胞器的分离是现代细胞生物学研究的*的手段之一。从脑组织或神经细胞分离突触体的技术方法基本上采用：*，通过机械方法破裂组织细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑、巨大细胞器（细胞核），剥离神经末端部分，且重新封口，形成膜性液囊（sac）；第三，通过高速差速离心获得突触体、质膜、髓磷脂（myelin）、内质网、突触体外线粒体；甚至第四，可以通过等密度离心获得纯度更高的突触体，去除髓磷脂（myelin）和突触体外线粒体等。 

产品内容

 清理液（Reagent A）    毫升

 裂解液（Reagent B）    毫升

 活性液（Reagent C）    微升

 高纯液A（Reagent D1）    毫升

 高纯液B（Reagent D2）    毫升

 高纯液C（Reagent D3）    毫升

 高纯液D（Reagent D4）    毫升

 保存液（Reagent E）    毫升

产品说明书    1份

保存方式

保存 裂解液（Reagent B）和 活性液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

HANK平衡盐缓冲溶液（GMS12028）或PBS缓冲溶液（GMS12033）：用于清理细胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离

*细胞培养液（GMS12052）：用于细胞处理所需的培养基

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

50毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

4℃台式离心机：用于样品操作

4℃超速离心机：用于样品操作

DOUNCE匀浆器：用于裂解组织细胞

实验步骤

• 组织突触体分离

• 手术取出动物脑组织，并秤重以确定1克组织重量 
• （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入xx毫升 清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎组织
• 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
• 加入xx毫升预冷的 裂解液（Reagent B）
• 加入xx微升 活性液（Reagent C）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀
• 即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器
• 在冰槽里用匀浆棒匀化组织（约20至40下）（注意：参见注意事项7）
• 将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g
• 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 移取xx毫升的 高纯液A（Reagent D1）到10毫升超速离心管（注意：使用前摇匀 高纯液A(Reagent D1)）
• 移取xx毫升的 高纯液B（Reagent D2）在 高纯液A（Reagent D1）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀 高纯液B(Reagent D2)）
• 移取xx毫升的 高纯液C（Reagent D3）在 高纯液B（Reagent D2）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀 高纯液C(Reagent D3)）
• 移取xx毫升的 高纯液D（Reagent D4）在 高纯液C（Reagent D3）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀 高纯液D(Reagent D4)）
• 轻轻加入xx毫升神经突触体粗提掖在 高纯液D（Reagent D4）的上面，避免震动
• 放进4℃超速离心机离心5分钟，速度为31000g
• 小心取出超速离心管：可见 高纯液C（Reagent D3）和 高纯液D（Reagent D4）交接处的样品带（注意：下1/5；见下图） 

• 小心抽去样品带以上的液体
• 小心收集下1/5样品带到15毫升锥形离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯突触体样品
• 加入xx毫升 保存液（Reagent E）
• 放进4℃超速离心机离心30分钟，速度为20000g
• 小心抽去上清液
• 加入x微升 保存液（Reagent E），混匀
• 即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
• 放进－70℃冰箱里保存

二、细胞突触体分离

• 准备5至10瓶75cm²细胞培养瓶的细胞（5 X 10⁷），直至细胞生长铺满整个培养表面
• 分别加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去
• 重复实验步骤2一次
• 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面
• 置入37℃培养箱3分种
• 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落，
• 分别加入10毫升用户自备的*细胞培养液
• 移入一个50毫升锥形离心管
• 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升预冷的 清理液（Reagent A），混匀细胞
• 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升预冷的 裂解液（Reagent B）
• 加入xx微升 活性液（Reagent C）
• 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群
• 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器
• 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约20至40下）（注意：参见注意事项7）
• 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管
• 放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1000g
• 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
• 移取xx毫升的 高纯液A（Reagent D1）到10毫升超速离心管（注意：使用前摇匀 高纯液A(Reagent D1)）
• 移取xx毫升的 高纯液B（Reagent D2）在 高纯液A（Reagent D1）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀 高纯液B(Reagent D2)）
• 移取xx毫升的 高纯液C（Reagent D3）在 高纯液B（Reagent D2）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀 高纯液C(Reagent D3)）
• 移取xx毫升的 高纯液D（Reagent D4）在 高纯液C（Reagent D3）的上面，避免震动（注意：使用前摇匀 高纯液D(Reagent D4)）
• 轻轻加入xx毫升神经突触体粗提掖在 高纯液D（Reagent D4）的上面，避免震动
• 放进4℃超速离心机离心5分钟，速度为31000g
• 小心取出超速离心管：可见 高纯液C（Reagent D3）和 高纯液D（Reagent D4）交接处的样品带（注意：下1/5；见下图） 

• 小心抽去样品带以上的液体
• 小心收集下1/5样品带到15毫升锥形离心管（注意：用3毫升针筒和18号针头，置于样品带下缘小心缓慢抽吸）——此步骤获得高纯突触体样品
• 加入xx毫升 保存液（Reagent E）
• 放进4℃超速离心机离心30分钟，速度为20000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 保存液（Reagent E），混匀
• 即刻移入到预冷的1.5毫升离心管
• 放进－70℃冰箱里保存

注意事项

• 本产品为10次（1克动物组织或5 X 10⁷细胞）操作
• 所有操作均须严格在4℃或以下状态进行
• 操作时，须戴手套
• 操作时，须严格无菌操作，避免污染母液 
• 建议使用足够的样品量
• 建议严格控制操作时间
• 通常匀化次数为20至40下（或细胞颗粒群/组织块状消失为止）达到80％的细胞裂解为理想状态，但不同的组织或细胞类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数
• 通常1克动物脑组织或5 X 10⁷细胞的突触体含量为2至4毫克以上突触体蛋白

9． 本产品所获得的突触体纯度（可达到99％）和产量*理想

10． 使用 高纯液（Reagent D）前，须摇匀后加入；并注意避免污染母液

• 根据超速离心管的大小调整 高纯液（Reagent D）的使用量或在样品上面加上石蜡油填满
• 本公司提供系列突触体分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定分离的突触体结构完整
• 本产品经鉴定分离的突触体维持正常活性
• 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶