快速分析中色谱柱的选择 系列攻略之关于流动相的置换速度

近年来，在液相色谱分析领域，“快速分析”的话题越来越多被提起。

在2020年版《中国药典编制大纲》中，也提到“积极倡导绿色标准和经济标准，推广采用毒性小、污染少、节约资源、保护环境、简便实用的检测方法”。

我们总结了一系列快速分析中色谱柱的选择攻略，这是后一篇啦~没看过前面的老师可以点击文字标题查看哟~↓↓↓

★ 快速分析时的关键因素

：关于粒径（点击查看）

第二弹：关于流速与柱压（点击查看）

★ 快速分析时色谱柱特性的关键点

第三弹：填充技术与高流*果（点击查看）

第四弹：色谱柱的化学性质（点击查看）

第五弹：关于流动相的置换速度

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流动相的置换速度

设定好的流动相条件在色谱柱中的置换速度对快速分析来说至关重要。

全多孔型填料的保留能力及负载量都很优秀，但细孔内的扩散会导致色谱柱内的液体组成变化需要一定的时间。

如下图所示，当填料粒径缩小时，在构造上，由于扩散带来的液体置换范围变窄，因此液体置换速度更快——在进行梯度条件的多组分分析时，流动相的置换速度将对分析结果产生很大影响。

▲ 不同尺寸填料粒子的扩散情况

下面，将通过展示一个肽谱分析数据例，说明不同粒径尺寸对于流动相置换速度的影响。

如下图，分别使用5 μm的MGIII和2 μm的IF柱，在40分钟的梯度条件下对人血白蛋白胰蛋白酶分解物进行分析。

IF柱所得结果与MGIII相比，各色谱峰之间的整体分离度未见明显提升，反而由于小粒径导致高柱压，*没有体现出小粒径色谱柱的优势。这是因为填料粒子表面在平缓的梯度条件下，由于扩散作用导致流动相置换速度变慢，因此填料粒径所带来分离性能上的差别未能在结果中体现出来。

▲ 一般梯度条件下人血白蛋白胰蛋白酶分解物的分析结果

流动相：A) 0.05 vol% TFA水溶液

             B) 0.05 vol% TFA乙腈水溶液

           B  2% （0.0 min）-> 50% (40 min) -> 2% (40 min) -> 2% (43 min)

流　速：200 μL/ min

检测器：UV 210 nm

样　品：人血白蛋白胰蛋白酶分解物

进样量：2 μL

如下图，在8分钟的快速梯度分析结果中，则体现了粒径差异对分析的显著影响：

▲ 快速梯度条件下人血白蛋白胰蛋白酶分解物的分析结果

流动相：A) 0.05 vol% TFA水溶液

             B) 0.05 vol% TFA乙腈水溶液

           B  2% （0.0 min）-> 50% (8 min) -> 2% (8 min) -> 2% (10 min)

流　速：200 μL/ min

检测器：UV 210 nm

样　品：人血白蛋白胰蛋白酶分解物

进样量：2 μL

粒径5 μm的MGIII填料粒子周围的液体组成变化和细孔内的液体置换之间出现延迟，因此出现了峰形变差的现象；

与此相对，粒径2 μm的IF柱的分析结果与40分钟结果相比，虽然分离度有所降低，但比5 μm柱所得峰形更尖锐，这就是填料内部液体置换迅速所带来的好处。