双荧光素酶报告基因检测服务

双荧光素酶报告基因检测服务 
 
双荧光素酶报告基因法（luciferase Assay）检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用
 
转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合，这些特异性的序列被称为顺式因子，转录因子的DNA结合域和顺式因子实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase Assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，其原理简述如下：
（1）       构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。
（2）       将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。
（3）       加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光素，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

实验步骤：
（1）       用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
（2）       设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。
（3）       筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。
（4）       扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。
（5）       培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。
（6）       将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。
（7）       提取蛋白并用于荧光素酶检测。
（8）       加入底物，测定荧光素酶的活性。
（9）       计算相对荧光强度，并与空载对照比较。
 
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