光学显微镜下材料显微结构的观察（金属、陶瓷材料、聚合物的显微观察）


一、目的要求
    1．观察不同材料在显微镜下的微观形态，通过本实验了解铁碳合金在平衡状态下的显微组织；认识和掌握对陶瓷材料进行相分分析和相量测定的方法；了解和观察高分子球晶的结构和形态
    2.掌握光学显微镜结构和使用方法               

二、基本原理
1．铁碳合金在平衡状态下的显微组织观察http://www.shkon.com.cn/produce/metalmicro/DMM700C.htm
    根据组织特点和含碳量的不同铁碳合金可分为工业纯铁、钢、铸铁三大类。工业纯铁含碳小于0.0218％C，碳含量小于2.11%的铁碳合金称为钢，碳含量大于2.11%的合金称为铸铁。
    碳钢和白口铸铁在室温下的组织均是由铁素体（F）和渗碳体（Fe3C）这两个基本相所组成，只是因含碳量不同铁素体和渗碳体的相对数量、析出条件以及分布情况有所不同，因而呈现各种不同的组织形态。
铁素体是碳在α铁中的固溶体，常用符号“ F ”表示。铁素体组织为等轴晶粒，晶体结构为体心立方晶格。
渗碳体是铁与碳形成的一种化合物，常用符号“ Fe3C ”表示。按成分和形成条件不同，渗碳体可呈现不同形态。
    珠光体是铁素体与渗碳体的机械混合物，常用符号“ P ”表示。在一般退火情况下，它是由铁素体和渗碳体相互混合交替排列形成的层片状组织。[url=http://www.baikon.com/index.php?id=128]DMM-330C透反射金相显微镜[/url]
    纯金属与单相合金的浸蚀是一个化学溶解过程，当把抛光后的试样与浸蚀剂接触时，首先抛光面上的形变扰动层被溶解掉，这时钢的显微组织没有任何的显露，紧接着是对晶界的化学溶解作用，在晶界上原子排列的规律性比较差，因而快速地被腐蚀掉形成凹沟，这时合金显示出多边形晶粒。若浸蚀继续进行则浸蚀剂将对晶粒本身起溶解作用，由于每个晶粒溶解的速度并不一致，浸蚀以后每颗晶粒都将按照原子排列zui密的面露出表面，在垂直光线的照射下将显示出明暗不一的晶粒。
    两相合金的浸蚀主要是电化学浸蚀过程。不同的相由于成分、结构的不同，具有不同的电极电位，在浸蚀液中形成了许多对微小的局部电池，铁素体具有较高的电极电位为阳极，浸蚀时发生溶解变得低洼粗糙，渗碳体具有正电位为阴极基本不受浸蚀。铁素体在光镜下呈暗黑色，渗碳体呈白亮色。
2．陶瓷材料相分和相量分析[url=http://www.baikon.com/index.php?id=287]XPF-330C偏反光显微镜[/url]
    在显微镜下观察陶瓷试样通常可以见到三个不同的相分，即晶相、玻璃相和气相。
   晶相是由晶体物质所构成，它的形状是比较规则的多边形，也可能是接近于圆形、长条状、针状以及树枝状等。这些情况除了和该晶体物质内部构成、晶体生长和杂质的掺入有关外，还和材料制造过程有关。晶相一般分主晶相和次晶相，主晶相是陶瓷材料的主体，它可以由单相多晶组成，也可以由多相多晶组成；次晶相的生成一般在晶粒内部或边界上析出，也可能在玻璃相中出现，常见的有针状、柱状、片状、球状等。http://www.shkon.com.cn/produce/polorize/XPF330C.htm
玻璃相为无定形体，在偏、反光显微镜下观察时呈现灰黑色，分布在晶粒的周围呈连续状或孤岛状，它在瓷体中起着结合强固的作用。
    气相在陶瓷结构中常见，它在很大程度上取决于挥发性杂质或结合剂等的含量、成型、烧成和热处理工艺。它的形状大小、分布及含量直接影响陶瓷的各种性能。在镜下观察气相时，都呈现黑色的孔洞，磨成光片不经腐蚀也能看到，这是由于空洞不反光的缘故。气孔的形状各异，有圆形、椭圆形、蠕虫状等，气孔有时包裹在晶体内部。
    陶瓷结构中的粒径、平均粒度及粒径分布也是表征显微结构特征的重要参数，其大小和均匀程度会直接影响诸多物理性能，如材料的强度、韧性、硬度、导热、导电、介电、敏感、腐蚀、催化、摩擦磨损、光的吸收与反射等都与粒径及分布特性密切相关。
3．聚合物球晶的观察[url=http://www.shkon.com/produce/polorize/XPR500C.htm]偏光熔点仪[/url]
    晶体和无定形体是聚合物聚集态的两种基本形式，很多聚合物都能结晶。聚合物晶体从形态上看有单晶、球晶、纤维晶、串晶、须晶等。在片状单晶体中分子链垂直于晶体表面，在纤维晶和须晶中，分子链沿纤维轴方向排列。聚合物从熔融状态冷却时主要生成球晶，它是聚合物晶体的主要形式，对制品性能有很大影响。www.shkon.com.cn蔡康偏光显微镜
    球晶是以晶核为中心成放射状增长构成球形而得名，是“三维结构”。但在极薄的试片中也可以近似的看成是圆盘形的“二维结构”，球晶是多面体。由分子链构成晶胞，晶胞的堆积构成晶片，晶片迭合构成微纤束，微纤束沿半径方向增长构成球晶。晶片间存在着结晶缺陷，微纤束之间存在着无定形夹杂物。球晶的大小取决于聚合物的分子结构及结晶条件，因此随着聚合物种类和结晶条件的不同，球晶尺寸差别很大，直径可以从微米级到毫米级，甚至可以大到厘米。球晶分散在无定形聚合物中，一般说来无定形是连续相，球晶的周边可以相交，成为不规则的多边形。球晶具有光学各向异性，对光线有折射作用，因此能够用偏光显微镜进行观察。另外还可以观察到黑十字消光图象。有些聚合物生成球晶时，晶片沿半径增长时可以进行螺旋性扭曲，因此还能在偏光显微镜下看到同心圆消光图象http://www.shkon.com.cn/produce/polorize.htm晶体用偏光显微镜

三、仪器和样品
    金相显微镜、偏光显微镜、工业纯铁、40钢、T8钢、亚共晶白口铁、聚丙烯球晶样品、SrTiO3压敏陶瓷、BaTiO3电介质瓷样品。www.shkon.com.cn偏反光显微镜,透反射显微镜

四、实验步骤
1. 金属材料的平衡组织观察
    观察的典型铁碳合金为工业纯铁、40钢、T8钢、亚共晶白口铁。用金相显微境行观察并比较各种典型合金的组织特征。
    绘出实验所观察到的试样组织图，在图中标明各组织组成物的名称，并比较其组织特征。
2.陶瓷材料的粒度测定
    （1）晶体粒径的测量
    测量时通常使用有刻度尺的目镜进行。目镜的十字丝上刻有100个小格（刻度尺），每一小格所代表的长度因放大倍数不同而不同。目镜刻度尺每格所代表的长度是利用载物台测微尺来标定的，载物台测微尺嵌于玻片上（或是金属板上），长1mm，分为100小格，每一小格为0．01 mm。
    ①测量原理：首先根据载物台测微尺，对一定的放大系统求出目镜刻度尺每一刻度的代表值，然后再用目镜刻度尺直接测量晶粒的粒度。
    ②测量方法：
    首*行目镜刻度尺标定。取“10×”目镜（附有刻度尺），将载物台测微尺置于载物台上进行准焦，使视域内同时见到两个显微尺。将两显微尺平行并移动载物台测微尺使两尺零点对齐，然后仔细观察两尺上分格线再次重合的地方，数出这一段长度中二尺各有的刻度数。例如目镜刻度尺56小格，载物台测微尺刻度为70小格，即目镜刻度尺56小格相对于载物台测微尺的70小格，于是目镜刻度尺每小格所代表的长度为：
 
    目镜刻度尺代表实际长度值求得后，就可以测定晶粒（或气孔）的平均大小了。即将欲测试样的晶粒（或气孔）移至目镜刻度尺上，读出欲测晶粒（或气孔）所占目镜刻度尺的格数就可以算出晶粒（或气孔）的实际尺寸。比如某一晶粒占据目镜刻度尺4格，则该晶粒的实际尺寸为12.5μm×4 = 50μm。
对多个晶粒（或气孔）进行测量，求其平均值，即为某种相分的晶粒（或气孔）的平均粒径值。对于等径的晶粒只需测一个方向，对于非等径的晶粒如长条状、柱状、针状等则必须分别求出其长短方向的尺寸，然后再求其平均值。
3. 偏光显微镜下聚合物球晶的观察
    将压片机升至240℃；放上盖玻片，再放上少量聚丙烯样品，待样品熔化后再盖上一片盖玻片，压制约一分钟，制成试片。打开上盖，使其缓慢自然降至室温，可制成较大的球晶。
偏光显微镜在使用前首先要对光，此时可装上低倍物镜和目镜，推出起偏片（起偏器），转动视场光阑，使    在目镜中看到的视域为zui亮，再推进起偏片，使得在两个偏振片正交时目镜的视域zui暗。其次是对焦，将制好的试片置于载物台观察，并慢慢提升镜筒，直至看到物象后，再转动微调手轮，使物象达到zui清楚为止。此时偏光显微镜即处于可用状态。用毕后，按取用时状态放好。
    把偏光显微镜调到可用状态后，将聚丙烯试片放在载物台上观察球晶形状，并测量聚丙烯球晶直径

   

    

 

医学和生物学常使用的各种显微镜

　　暗视野显微镜 　在普通光学显微镜台下配一个暗视野聚光器（图4）,来自下面光源的光线被抛物面聚光器反射，形成了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束,因此视野是暗的，视野中直径大于 0.3μm的微粒将光线散射，其大小和形态可清楚看到。甚至可看到普通明视野显微镜中看不见的几个毫微米的微粒。因此在某些细菌、细胞等活体检查中常常使用。
　　实体显微镜 　由双筒目镜和物镜构成。放大率 7～80倍。利用侧上方或下方显微镜灯照明。在目镜内形成一个直立的放大实像，可以观察未经加工的物体的立体形状、颜色及表面微细结构,并能进行显微解剖操作,也可以观察生物机体的组织切片。
　　[url=http://www.shkon.com/produce/fluoro/DFM60C.htm]荧光显微镜 　在短波长光波（紫外光或紫蓝色光,波长250～400nm）照射下，某些物质吸收光能，受到激发并释放出一种能量降级的较长的光波（蓝、绿、黄或红光，波长400～800nm），这种光称荧光[/url]  。某种物质在短光波照射下即可发生荧光，如组织内大部分脂质和蛋白质经照射均可发出淡蓝色荧光，称为自发性荧光。但大部分物质需要用荧光染料（如吖啶橙、异硫氰酸荧光素等）染色后，在短光波照射下才能发出荧光。荧光显微镜的光源为高压汞灯，发出的紫外光源经过激发滤光片（此滤光片可通过对标本中荧光物质合宜的激发光）过滤后射向普勒姆氏分色镜。分色镜将激发光向下反射,通过物镜投射向经荧光染料染色的标本。染料被激发并释放出荧光,通过物镜,穿过分色镜和目镜即可进行观察。目镜下方安置有屏障滤片（只允许特定波长的荧光通过）以保护眼眼及降低视野暗度（图4）。
荧光显微镜的特点是灵敏度高，在暗视野中低浓度荧光染色即可显示出标本内样品的存在，其对比约为可见光显微镜的 100倍。30年代荧光染色即已用于细菌、霉菌等微生物及细胞、纤维等的形态观察和研究。如用抗酸菌荧光染色法可帮助在痰中找到结核杆菌。 40年代创造了荧光染料标记蛋白质的技术这种技术现已广泛应用于免疫荧光抗体染色的常规技术中，可检查和定位病毒、细菌、霉菌、原虫、寄生虫及动物和人的组织抗原与抗体，可用以探讨病因及发病机理，如肾小球疾病的分类及诊断，乳头瘤病毒与子宫颈癌的关系等。 在医学实验研究及疾病诊断方面的用途日益广泛。
　　偏光显微镜 　从光源发出的光线通过空气和普通玻璃时，在与光线垂直的平面内的各个方向以同一振幅进行振动并迅速向前方传递，这是光的波动性原理。空气与普通玻璃为各向同性体，又称单折射体。[url=http://www.shkon.com/produce/polorize.htm]如果该光源的光通过一种各向异性体（又称双折射体）时，会将一束光线分为各只有一个振动平面的，而且振动方向互相垂直的两束光线。这两束光线的振动方向、速度、折光率和波长都不相同。[/url]这样只有一个振动平面的光线称偏振光。偏光显微镜即利用这一现象而设计。偏光显微镜内，在物镜与目镜间插入一个检偏镜片，光源与聚光器间镶有起偏镜片，圆形载物台可以作360°旋转（图5）。[url=http://caikon.diytrade.com]起偏与检偏镜片处于正交检偏位时，视野*变黑。将被检物体放在显微镜台上。若被检物为单折射体，则旋转镜台，视野始终黑暗。若旋转镜台一周，视野内被检物四明四暗，则说明被检物是双折射体。许多结晶物质（如痛风结节中的尿酸盐结晶、尿结石、胆结石等），人体组织内的弹力纤维、胶原纤维、染色体和淀粉样原纤维等都是双折射体，可借偏振光显微镜术检验，进行定性和定量分析。[/url]
 
　　[url=http://www.leikon.com.cn/produce/biology.htm]位相显微镜 　又称相差显微镜或相衬显微镜。普通光学显微镜之所以看不见未染色的组织、细胞和细菌、病毒等活机体的图像，是因为通过样品的光线变化差别（反差）很小。标本染色后改变了振幅（亮度）和波长（颜色），影响了反差而获得图像。[/url]但是染色会引起样品变形，也可使有生命的机体 。要观察不染色的新鲜组织、细胞或其他微小活体必须使用位相显微镜。[url=http://www.shkon.cn/produce/biology/XSP11CD.htm]位相显微镜的原理是两个光波因位相差而互相干涉，出现光波强弱和反差的改变而成可见影像。点光源发出的光线可以表现为正弦波图形（图6a）。[/url]两个波峰间的距离为波长,波的振幅表示光的亮度（振幅大、亮度高）。设想同一光源发出的两条光波,分别同时通过空气及某种透明介质。在通过一定厚度的某种透明介质时，光波的速度就会降低，但是光的亮度未变。光波在通过该透明介质后比一直在空气中前进的另一条光波迟滞了波长，因而两条光波出现了位相的变化（位相差）。但人眼不能分辨这两条平行光线的位相差。如果这两条光波射到光屏的同一点上，而且一条光波比另一条光波迟滞了半个波长，即两条光波因位相相反而互相干涉抵消则光线消失，或者相对振幅相互影响而光线减弱。如果一条光波虽然迟滞了一个波长,但两条光波位相相同,则因波的叠加而光线增强。
 
　　[url=http://www.leikon.com.cn/produce/biology/XSP13CC.htm]位相显微镜的基本结构与普通光学显微镜相同。不同之处在于：①物镜镜头上面，在物镜第二焦平面装有一块圆盘状的位相板（图6b）。[/url]②聚光器下面，在聚光器*焦平面装有环形光束，光束上刻有狭窄的缝隙可通过环形强光（图6c）。如图6d所示，环形光束 A点发出的光线经过聚光器后成为平行光线。光线通过载物台上的样品时，因样品内各个质点（如b点）的折射率不同而受到干涉，发生衍射,即分为未偏向波（实线）和偏向波（虚线）。未偏向波通过物镜聚焦于位相板 A' 点上成像，然后通过位相板，均匀地分布在标本像平面上成为背景。偏向波通过物镜后从位相板 A'点周围通过位相板同样聚焦在像平面的B'上。换句话说，未偏向波和偏向波是分别通过位相板的不同部位。在位相板上不同的区域涂有不同的涂层，可以分别改变未偏向波或偏向波的速度和亮度，由此两种光波出现了位相差，差了半个波长或一个波长，它们在像平面的合波就出现明暗对比，样品内的各个细节也就能看得见。
　　总之，[url=http://www.leikon.cn/produce/biology/XSP11CC.htm]位相显微镜是利用样品中质点折射率的不同或质点厚度的不等，产生光线的相位差，使新鲜标本不必染色就可以看到，而且能够观察到活细胞内线粒体及染色体等精细结构，还可以应用于霉菌、细菌、病毒等更微小活体的研究，进行标本形态、数量、活动及分裂、繁殖等生物学行为观察，并可进行量度与比较。 [/url]位相显微镜是利用样品中质点折射率的不同或质点厚度的不等，产生光线的相位差，使新鲜标本不必染色就可以看到，而且能够观察到活细胞内线粒体及染色体等精细结构，还可以应用于霉菌、细菌、病毒等更微小活体的研究，进行标本形态、数量、活动及分裂、繁殖等生物学行为观察，并可进行量度与比较。
　　倒置式显微镜 　普通显微镜镜的物镜头方向向下接近标本。倒置式显微镜的物镜镜头则处于垂直向上的位置，因此目镜和镜筒的纵轴与物镜的纵轴呈45度角。[/url]倒置式显微镜 　普通显微镜镜的物镜头方向向下接近标本。倒置式显微镜的物镜镜头则处于垂直向上的位置，因此目镜和镜筒的纵轴与物镜的纵轴呈45度角。载物台面积较大，在物镜上方，载物台上方有一个长焦距聚光器和照明光源。物镜和聚光器可装配位相显微镜的附件。放大率16～80倍。组织培养瓶和培养皿可以直接放在载物台上，进行不染色新鲜标本及活体、细胞的形态、数量和动态观察。可进行多孔微量生物化学及免疫反应平板的结果观察。倒置式显微镜可换用普通亮视野光学镜头；可装配偏振光、微分干涉差、荧光附件进行观察。
　　微分干涉差显微镜（DIC） 　又称干扰或干涉显微镜。能看到和测定微小的位相变化，与位相显微镜相似，使无色透明的标本具有明暗和颜色的变化，从而增强反差。在普通光学显微镜的基本结构上安装偏光和干涉部件，以及360°旋转载物台。它又利用偏振光的干涉原理。如图7所示,在光源上方安置有起偏镜片和光束分解棱镜。从起偏镜片出来的直线偏振光通过光束分解棱镜后，分成互相垂直振动的两条直线偏振光。两条光线经聚光器折射后射向样品。因样品内各个质点的折射射率不同，部分光波的位相改变及因干涉而发生横向偏移。两条光线通过物镜后经第二组光束分解棱镜相合并，由检偏镜发生干涉。终末像的每一个点是由物体上同一点的两个互相重叠的不同图像构成的一种混合像，从而使肉眼得以辨识。 
　微分干涉差显微镜同样可以观察到在普通亮视野中看不见的无色透明物体,可以观察细胞、细菌等活体,而且影像呈立体感，较位相显微镜的影像更细致、更逼真。可用它对活细胞的各个部位作更精细的研究。如果用白光照明，不同位相表现为各种颜色，转动载物台，颜色会发生变化。单色光照明产生明暗反差，各种成分呈现不同的对比度。微分干涉差显微镜又可以作为一种高度精密的超微量光学天平来使用，用以估测的干物体的质量可以小到 1×-14克。当细胞中所含固体物质的浓度增加百分之一时，其折射率相应增加0.0018。细胞各相成分的折射率可以根据它与相关区域（悬浮液区）间位种的不同而估计，从而可进一步算出一个细胞中某些成分的干燥重量。