蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南五

反相液相色谱和质谱（MS）的联用为蛋白质/多肽分析提供了强大的工具。
20世纪80年代，约翰·贝内特·芬恩和他的同事们开发了电喷雾离子源，使质谱与反相液相色谱得以联用。
采用液相色谱-质谱联用的好处包括：

• 质谱是非常灵敏的检测技术。

• 质谱可以提供所分离多肽/蛋白质的分子量。

• 质谱可利用分子量特异性检测蛋白质。

• 片段信息有助于确认多肽。

• 质谱基于电荷和质量进行分离和测定，因此，与基于疏水性分离的反相色谱“正交”。

液相色谱-质谱联用广泛用于肽图的分析，提供了一种正交检测肽法（参考文献15）。
如图26所示，总离子质量色谱图与紫外色谱图相似，但由于正交检测的使用，峰的大小不同。
事实上，采用紫外检测出现的小峰在质谱图中会更明显（见图26“^*”）。
 

图26. 肽图的分离可以通过紫外检测和质谱检测来监测。
峰高是检测法的一个函数，在紫外图谱和质谱图谱间有明显不同。
特别是用“*”标示的肽对。它们在UV检测图谱中显示的峰值较小，但在质谱图中峰值较大。

通过测定每个峰中肽的分子量，质谱分析法为识别RP-HPLC法分离的峰提供了有用的信息。
由于质谱与反相液相色谱正交，因此质谱还能确定峰纯度或显示两种或两种以上肽的共洗脱，并能提供肽的分子量。
图27以肽图中的三个峰值展示了这一点。A峰较早洗脱出来，是分子量为439道尔顿的四肽。B峰是一种糖肽，有寡糖或多聚糖吸附。
通过质谱图中B峰存在质荷比为204和366两种离子确定，这表明存在糖基化反应。
C峰是一种二硫化物连接的二肽——由二硫键连接的两个多肽。
显示该肽有四种离子形式：+1、+2、+3和+4。只有含两个氨基末端和两个碱性氨基酸的二肽才会出现+4离子。

图27. 反相色谱强大的分离能力与第二个维度的质谱的结合为肽图提供了大量的信息。

A. MS确认A峰代表小分子肽。

B. 检测到的B峰代表含多聚糖（糖）的肽。

C. C峰代表一种二肽——由二硫键连接的两个肽。

HPLC-MS

联用的两个重要因素是电喷射接口的蕞佳流速及三氟yi酸对肽电离的影响

基本电喷雾接口的信号在5~10μL/min的流速区间上迅速下降（图28）。
这与采用标准分析型HPLC柱的流速不相容。
目前，商用电喷雾提供一种高剪切流氮气辅助的电喷雾（气流辅助电喷雾），它将电喷雾的蕞佳流速区间提升到了200~500μL/min。
这仍然低于标准分析柱通常所用的蕞佳流速，因此，目前科学家在使用HPLC-MS时，普遍采用流速为200~300μL/min的细孔柱（内径~2 mm）

图28. 红线表示基本电喷雾接口流速与信号响应的关系。蓝线同样表示气流辅助电喷雾的信号响应。

如图29所示，流动相中的TFA流入电喷雾接口导致蛋白质和多肽的信号减弱。
这是由于TFA和多肽间强烈的相互作用将多肽中和。

图29. 使用电喷雾接口时，TFA的流入会大幅减弱多肽的信号。

有两种方法可纠正由TFA引起的信号减弱：

• 忽略信号损失。通常，当信号足够强大时，即使信号减弱也仍能获得有用的数据。在这种情况下可以忽略信号损失。

• 当信号损失过多时，蕞佳的解决方案是将高纯度硅胶柱与低浓度TFA结合使用。
  高纯度硅胶柱与低浓度TFA一同使用仍能维持较好的峰形（图30）。
  采用高纯度硅胶柱能得到良好的信号响应和峰形。

其它方案包括用甲酸代替TFA或柱后采用乙酸或丙酸代替TFA。
但采用甲酸得到的峰形不如TFA，分离度也不如TFA，因此会影响性能。
这在蛋白质组学应用中可以接受，但在蛋白质治疗药物中不可行。
柱后替换TFA较为棘手，且会导致分辨率下降。

图30. 高纯度硅胶与低浓度TFA一同使用，保持肽的峰形。

色谱柱：ACE 5 C18, 4.6 x 250 mm（高纯度硅胶）

洗脱液：加入如图所示的TFA，以10%-55%的乙腈（ACN）梯度洗脱，洗脱时间为37.5分钟。