科研达人分分钟带你入戏丨关于感受态细胞，你不可不知的那些事儿~

01

 为什么DH5α生长速度慢/长斑小？

原因：

（1）DH5α感受态细胞生长速度较慢；

（2）涂板菌液太多，菌落过多，导致菌落生长速度慢/菌落小。

方案：

（1）延长菌的生长时间；

（2）建议减少菌液涂布量，剩下的菌液可放4℃保存，看菌的生长状况再决定去留。

02

DH5α和DH5α-的区别是什么？

DH5α需要IPTG和X-Gal共同使用进行蓝白斑筛选。

DH5α-无需加入IPTG，只需X-Gal即可进行蓝白斑筛选。

03

Mach1T1和Turbo哪个生长速度快？

Turbo

04

细菌怎么实现抗噬菌体的特点？

（1）抑制吸附：改变细菌表面的受体蛋白结构，受体缺失，竞争性抑制产物的作用等；

（2）阻止噬菌体DNA的注入；

（3）降解或干扰噬菌体DNA；

（4）流产感染。

05

DB3.1细胞是怎样实现含有ccdB基因在细胞内扩增的？

ccdB蛋白的毒性作用是通过与促旋酶GyrA亚基第462位氨基酸相结合使得DNA断裂后不能进行修复，DNA合成受阻，导致细胞死亡。

DB3.1菌株的细胞含有gyrA462基因，能够表达GyrA亚基蛋白与ccdB结合的区域，可以竞争性抑制ccdB蛋白的活性，使得促旋酶可以正常行使功能，实现含有ccdB的载体的正常扩增。

06

 从JM110细胞制备的质粒可以用于基于Dpn I消化的点突变试剂盒吗？

不能。JM110是甲基化基因dam，dcm缺失突变株，在其内扩增的质粒无法进行甲基化，而点突变试剂盒中的DpnⅠ的作用是消化甲基化的模板质粒。

注：

（1）基于DpnⅠ消化的点突试剂盒是以甲基化的载体质粒作为模板，设计一对点突引物进行扩增；

（2）使用DpnⅠ消化甲基化的模板质粒；

（3）PCR扩增的片段没有甲基化，因此不能被DpnⅠ消化降解；

（4）将DpnⅠ消化后的产物转入感受态细胞。

07

大肠杆菌质粒甲基化有哪几类？通过何种方法可以去甲基化？何种方法来验证质粒已经去甲基化？JM110可以用于大量质粒制备吗？

2种，Dam，Dcm（Dam甲基化酶可将GATC序列中的腺嘌呤N6位点进行甲基化修饰，Dcm甲基化酶可将CCAGG和CCTGG序列中胞嘧啶C5位点进行甲基化修饰）。  

可以将质粒转化进入JM110感受态细胞中，实现质粒的去甲基化。

可以使用XbaⅠ酶切的方法验证质粒是否去甲基化。

不可以，JM110感受态细胞转化效率低，并且它不能使质粒甲基化，容易引起突变。

08

stbl3和stbl4的区别（菌株是从哪家公司来的）？适用于哪种类型的质粒构建？

区别：（Stbl3和Stbl4菌株是从invitrogen公司来的）Stbl3为链霉素抗性菌株，Stbl4是四环素抗性菌株。Stbl4较Stbl3生长较慢。

适用于逆转录病毒或慢病毒质粒的构建，即带有5’-LTR和3’-LTR结构的质粒，如pLV-Flag质粒。

09

蓝白斑筛选原理是什么？

（1）蓝白斑筛选的条件是具有LacZα编码区的载体与可以进行α-互补的宿主细胞（如Mach1-T1、*0、DH5α、JM109、DH10B和NEB10-beta等）配合使用；

（2）一些载体具有LacZα基因编码区，可以编码LacZ蛋白N端的α片段（此编码区中含有多克隆位点，允许外源基因的插入）。其宿主细胞是一种仅可以编码LacZ蛋白C端ω区域的细胞，载体和宿主单独产生的LacZ片段并没有β-半乳糖苷酶活性；

（3）当载体进入宿主细胞时，载体的α片段和宿主的ω片段实现了互补，由α-互补产生的β-半乳糖苷酶具有活性，在IPTG和X-Gal的存在下，菌落变为蓝色；

（4）但是当外源基因插入到在载体LacZα编码区中，破坏了LacZ基因α片段的正常表达，使得其与宿主细胞不能进行α-互补，因此在IPTG和X-Gal的存在下，菌落为白色。

10

DH10B和DH10Bac有何区别？

DH10B是一种可以用来进行大质粒（>8 kb）转化的克隆感受态细胞。

DH10Bac是一种用于昆虫杆状病毒Bac-to-Bac系统中同源重组所用的菌株，其可用于pFastBac系列质粒（如pFastBacl和pFastBacDual）的转化。其感受态细胞中含有用于pFastBac系列质粒重组的Bacmid和辅助质粒。

11

BL21 和BL21(DE3)的区别是什么，DE3代表什么基因？

BL21(DE3)是在BL21菌株的基因组上整合了T7 RNA聚合酶基因，适合于T7系统的表达（具有T7 promoter）。

DE3是一段可以表达T7 RNA聚合酶的序列，通过溶原性噬菌体将序列整合到细菌基因组中。

12

 BL21(DE3)和T7 express表达菌有什么区别？

T7 express表达菌株来源于BL21菌株，T7 express与BL21(DE3)的主要区别在于T7 express菌株的T7 RNA聚合酶基因整合在菌株基因组中的Lac操纵子区域，并具有抗T1噬菌体感染的特点。BL21（DE3）菌株中的T7 RNA聚合酶基因来源于噬菌体溶原方法，存在噬菌体成分。

13

表达含有稀有密码子的基因需要选择哪类感受态细胞，这类细胞实现表达的原理是什么?

Rosetta（DE3）

Rosetta（DE3）具有一个带有氯霉素抗性的质粒，可以补充6种稀有密码子的tRNA（精氨酸 Arg R: AGA  AGG，异亮氨酸 Ile I: AUA， 脯氨酸 Pro P CCC， 亮氨酸Leu  L：CUA，甘氨酸 Gly G:GGA）。

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使用BL21(DE3)细胞进行蛋白表达时，细胞一诱导就死，请问用什么方法解决？

可以使用BL21（DE3）pLysS 或T7pLysY表达菌株。

15

pLysY和pLysS有什么区别？

pLysY表达的T7溶菌酶保留了对T7RNA聚合酶的抑制作用，但是缺失了水解细胞壁的酰胺酶活性，避免了诱导过程中细胞的裂解。

pLysS表达的T7溶菌酶具有完整活性。

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 含有二硫键的蛋白请问用何种感受态细胞比较好？

OrigamiB（DE3）或Shuffle T7-K12，Shuffle T7-B。

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增加表达蛋白的可溶性表达采用何种感受态细胞？

OrigamiB（DE3）或Shuffle T7-K12，Shuffle T7-B。

18

使用OrigamiB（DE3）感受态细胞时应该注意什么？

OrigamiB（DE3）感受态细胞具有卡那霉素和四环素抗性，所以转化的质粒不能是卡那霉素抗性或四环素抗性的。

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说明书上写这XL10-Gold细胞具有四环素和氯霉素抗性，我的质粒是氨苄青霉素抗性，请问转化这个质粒时，需要加四环素和氯霉素抗生素吗？

不用，四环素和氯霉素是在菌株的基因组中稳定存在的，不用加这两种抗生素。

20

下面的抗生素如何配制，工作浓度是多少？

配置方法：通常抗生素是以工作浓度1000倍的浓度储存的。以配置10ml的Amp为例，首先称取1 g粉末状的氨苄抗生素药品，装入15 ml EP管中，使用ddH2O溶解并定容到10 ml，摇晃使其*溶解后，使用0.22 μm的过滤器过滤除菌，分装到1.5 ml EP管中保存使用。

21

Rosetta（DE3）感受态细胞的工作原理是什么？

Rosetta（DE3）具有一个带有氯霉素抗性的质粒，可以补充6种稀有密码子的tRNA（精氨酸 Arg R: AGA  AGG，异亮氨酸 Ile I: AUA， 脯氨酸 Pro P CCC， 亮氨酸Leu  L：CUA，甘氨酸 Gly G:GGA）。

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转化效率可达10⁸ cfu/μg，是什么意思？如何测定转化效率？

指的是每微克超螺旋构象的DNA即pUC19（2686 bp）经转化后可以得到的阳性克隆菌落的个数为10⁸个。

大肠杆菌感受态通常使用0.1 ng/μl pUC19作为测定转化效率的质粒，在100 μl感受态细胞中加入1 μl pUC19质粒，转化完成后加入900ul SOC孵育1 h（此时pUC19的浓度为0.1 ng/ml），其后吸取10 μl菌液稀释到990 μl SOC中（此时pUC19的浓度为0.001 ng/ml），吸取100 μl菌液涂在抗性板（此时pUC19的含量为0.0001 ng），37℃培养过夜后，数取菌落个数并计算转化效率。假设平板生长菌落数为100个，那么转化效率计算公式:

100 cfu/0.0001ng=1×10⁹ cfu/μg

农杆菌感受态通常使用超螺旋构象的100 ng/μl pCAMBIA2301（11633 bp）作为测定转化效率的质粒。

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羧苄青霉素为何比氨苄青霉素在摇菌中效果要好？

细菌生长过程中培养基pH降低，羧苄青霉素在pH降低的情况下仍可稳定存在，而氨苄青霉素在pH降低后不稳定，易降解。

24

氨苄抗生素的平板上的卫星菌落是如何产生的？

具有Amp抗性的细菌生长过程中会产生β-内酰胺酶，并释放到细胞外。而β-内酰胺酶可以降解氨苄抗生素，使得菌落周围没有了抗性，长出卫星菌落。

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需要做phage display（噬菌体展示实验），请问用哪种感受态细胞？

XL1-Blue感受态细胞

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分别简单叙述一些大肠杆菌感受态细胞和农杆菌感受态细胞的转化操作步骤

大肠杆菌感受态细胞转化步骤：

（1）将100 μl感受态细胞放在冰上溶解；

（2）将1-10 μl的连接产物加入到100 μl感受态细胞中，轻弹底部混匀；

（3）冰上孵育20-30 min；

（4）42℃，热击90 sec；

（5）迅速放到冰上孵育2 min；

（6）加入900 μl 无抗性LB，200 rpm ，37℃孵育1 h；

（7）6000 rpm离心收集菌，弃掉900 μl 上清，使用剩余的LB轻轻重悬菌液；

（8）将重悬菌液涂在相应的抗性板上。

注：具有Amp抗性的质粒(<8 kb)转化后，可以不经过孵育直接涂板。

农杆菌感受态细胞转化步骤：

（1）将100 μl感受态细胞放在冰上溶解；

（2）将1-10 μl的连接产物加入到100 μl感受态细胞中，轻弹底部混匀；

（3）冰上孵育5 min，液氮5 min，37℃放置5 min，冰浴5 min；

（4）加入900 μl SOC培养基，28℃振荡培养2-3 h；

（5）6000 rpm离心收集菌，弃掉900 μl 上清，使用剩余的SOC轻轻重悬菌液；

（6）将重悬菌液涂在相应的抗性板上。

27

具有卡那抗性的质粒pEGFP-N1为什么不能转化到4种农杆菌感受态细胞中？

因为pEGFP-N1不具有农杆菌的复制起始子，所以不能在农杆菌中扩增。

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农杆菌细胞是如何将外源基因转移植物细胞核基因组中的？

小知识：农杆菌转化的双元载体系统  

包含两个不同的质粒：一种是野生宿主源的小复制子（wide-host-range small replicon），含有一复制起始点（ori），能够让质粒在包括大肠杆菌和农杆菌在内的细菌内维持生长，这类质粒通常含有a）替换T-DNA的外源DNA。b）T-DNA左右边界序列（或至少含T-DNA右边界）。c）同时维持和筛选大肠杆菌和农杆菌的标记基因。d）植物生长的筛选标记基因。 一种是辅助型Ti质粒（helper Ti plasmid），缺乏完整的T-DNA区域，但是含有完整的vir区，能够激活T-DNA的转移。

（1）构建重组质粒，将目的基因插入到T-DNA区，随后将重组质粒转化进入农杆菌感受态细胞中；

（2）农杆菌含有Ti 质粒，借助Ti质粒的功能，使插入目的基因的T-DNA转移进宿主植物中并进一步整合、表达。

29

LB，SOB，SOC，2×YT培养基的区别是什么？

LB培养基用于一般的细菌培养。

SOB培养基是一种富营养培养基。与LB培养基相比，SOB培养基中含有两倍多蛋白胨，蛋白胨中富含氨基酸及多肽。另外，SOB培养基中含有镁离子，镁离子是高密度培养必须的离子。在SOB培养基中的大肠杆菌具有更高的转化效率。
SOC培养基是SOB加入葡萄糖以抑制分解代谢，增加生长速度。

2×YT 培养基是比LB培养基营养更为丰富的培养基。细胞能够生长更长的时间，浓度达到更高的值。

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制备腺病毒选择哪个感受态细胞？

BJ5183-AD-1或BJ5183

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感受态细胞Shuffle T7-K12和Shuffle T7-B 感受态细胞有什么区别？

Shuffle T7-K12来源于K12菌株，可以组成型表达LacI阻遏蛋白，降低基因表达的背景，有利于毒性蛋白的表达。

Shuffle T7-B 是BL21 增强型菌株，适合非毒性蛋白的表达。

不同的蛋白在这两种细胞中的可溶性差异很大，所以建议两种都试一下。

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