siRNA表达载体的构建

目的基因

LB培养基

离心管 离心机 水浴锅 漩涡振荡仪

一、目的基因的确定

1.  检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对）。

2.  NCBI查阅

3.  搜索引擎辅助

二 、设计siRNA靶序列

在制备siRNA 前都需要单独设计siRNA序列.研究发现对哺乳动物细胞,有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3’端有两个突出碱基的双链RNA；而对非哺乳动物，比较有效的是长片段dsRNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。

1.  选择siRNA靶位点

从转录AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA 3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions,UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。

2.  序列同源性分析

将潜在的序列和相应的基因组数据库（人或者小鼠、大鼠等等）进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）选出合适的目标序列进行合成.并非所有符合条件的siRNA都一样有效,其原因还不清楚，可能是位置效应的结果,因此对于一个目的基因，一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA。

通常来说，每个目标序列设计3-4对siRNAs，选择有效的进行后续研究。

3.  设计阴性对照

一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA中的碱基序列打乱。当然，同样要保证它和其他基因没有同源性。

三、表达载体的选用

1.  化学合成与体外转录方法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内，但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点：siRNA进入细胞后容易被降解；进入细胞siRNA在细胞内的RNAi效应持续时间短.针对这种情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链模板序列克隆入载体的RNA聚合酶III的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。这种方法总体的优点在于不需要直接操作RNA，能达到较长时间的基因沉默效果。

2.  通过质粒表达siRNAs大都是用Pol III启动子启动编码shRNA(small hairpin RNA)的序列。选用Pol III启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4—5个连续的U即终止，非常。当这种带有Pol III 启动子和shRNA模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，可抑制外源基因和内源基因。采用质粒的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因表达。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起其它合成方法来说，这就能够显著降低制备siRNA的成本。

3.  带有抗生素标记的siRNA表达载体可用于长期抑制研究，通过抗性辅助筛选，该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达数星期甚至更久。同时RNAi-Ready表达载体还能与逆转录病毒和腺病毒表达系统整合（BD Knockout RNAi Systems），大大提高siRNA表达载体对宿主细胞的侵染性,*克服某些细胞转染效率低的障碍，是实现哺乳动物细胞siRNAs瞬时表达与稳定表 达的理想工具。

四、合成模板

1.  合成编码 shRNA的DNA 模板的两条单链，模板链后面接有RNA PolyIII聚合酶转录中止位点，同时两端分别设计 BamH I 和 Hind III 酶切位点，可以克隆到 siRNA 载体多克隆位点的 BamH I 和 Hind III 酶切位点之间。
 

2.  95℃，5 min，缓慢退火， DNA 单链得到 shRNA 的 DNA 双链模板。

五、连接与转化

1.  将100 μl感受态细胞于冰上解冻。

2.  取5 μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物，在冰上放置30分钟。

3.  将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。

4.  每管中加700 μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行复苏。

5.  室温4 000 rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100 μl培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面.注意：细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。

6.  将平板置于室温直至液体被吸收。

7.  倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。

六、PCR鉴定和测序鉴定

在插入编码shRNA的DNA双链模板两侧设计鉴定PCR引物，扩增片段在100-200，bp之间。

1. 从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。

Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。

2. 将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）

3.  选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到有效的siRNA序列。

4.  一个完整的siRNA实验应该有负对照，作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。

如果计划合成siRNA，那么可以直接提供以AA打头的21个碱基序列，厂家会合成一对互补的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3’dTdT结尾，如果要UU结尾的话通常要特别说明。有结果显示，UU结尾和dTdT结尾的siRNA在效果上没有区别。因为这个突出端无需和靶序列互补。

一、siRNA操作成功要点

1. 对每个基因设计并检测两到四个siRNA序列

为了找到潜在靶位点，扫描靶基因中的AA序列。记录每个AA 3’端19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点。潜在靶位点需通过GENBANK数据库的BLAST分析，去除那些与其它基因明显同源的靶位点。如果可能，siRNA应根据mRNA低二级结构的区域设计。

2.  选择低GC含量的siRNA

Ambion公司研究发现GC含量在40-55%的siRNA比55%以上的活性高。

3.  纯化体外转录siRNA

在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱(Ambion siRNA体外合成试剂盒中已包括纯化柱保证siRNA纯度)或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE胶纯化)。

4.  避免RNA酶污染

微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品…因此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。Ambion公司在这方面有一整套的产品线，如除RNA酶的喷剂，拭纸及液剂，检测和去除RNA酶。

5.  健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性

通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。

6. 避免适用抗生素

Ambion公司推荐从细胞种植到转染后72小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到较好转染效果。QIAGEN推出的专门针对RNA转染的试剂

7.  选择好的转染试剂转染siRNA

针对靶细胞类型，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。siRNA实验要求选择适合转小的RNA的转染试剂(目前大多数转染试剂都针对转染比较大的质粒DNA，而非小的RNA分子，宿主范围大小也不同)。Ambion公司的Silencer siRNA Transfection Kit，QIAGEN的Transmessenger Transfection Reagent都是专门针对转siRNA优化的转染试剂，是您的理想选择。

8.  通过合适的阳性对照优化转染和检测条件

对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞(同样适合实验靶siRNA)，转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。Ambion公司提供多种靶基因的阳性siRNA。

9.  通过阴性对照siRNA排除非特异性影响

合适的阴性对照可通过打乱活性siRNA的核苷酸顺序设计而得。必须注意它要进行同源比较确保相对所要研究的生物的基因组没有同源性。

10.  通过标记siRNA来优化实验

荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。