Z小抑菌浓度测定试验（琼脂稀释法）

1 原  理 
    本试验采用琼脂稀释法将不同浓度的抑菌剂混合溶解在琼脂培养基中，然后点种细菌，通过细菌的生长与否，确定抗（抑）菌物质抑制受试菌生长的zui低浓度，即zui小抑菌浓度（Minimal  Inhibitory  Concentration，MIC）。本方法适用于非溶出性抗（抑）菌产品抗（抑）菌效果的鉴定。  

2 实验材料及器材 

（1）实验菌株  金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大肠杆菌 8099或ATCC 11229，可根据抑菌剂的用途，选择特定的菌株  
（2）营养琼脂培养基，制备后经高压灭后，置 45℃～50℃水浴备用，此培养基将用于对照试验  
（3）磷酸盐缓冲液  0.03mol/L，pH7.2

（4）灭菌蒸馏水 
（5）加样器（1μL～10μL）

（6）45℃～50℃水浴恒恒温培养箱

（7）吸管、试管、平皿

（8）37℃恒温培养箱

3  操作步骤 

（1）抗（抑）菌溶液的配制：以无菌操作取 5mL或 5g（固体研磨后）样品，放入 45mL 灭菌蒸馏水中，充分振荡溶解，配成 10% 的均匀分散的溶液或悬液。 

（2）抗菌剂稀释液配制：将已配成 10% 的抗（抑）菌溶液或悬液用蒸馏水做对倍系列稀释成不同浓度的受试液，置 45℃～50℃ 水浴恒温备用。  

（3）双倍浓度营养琼脂培养基：制备后经高压灭菌后，置 45℃～50℃ 水浴备用，此培养基将用于稀释抗（抑）菌溶液或悬液。 

（4）含抗（抑）菌液培养基的配制：分别取 10mL 系列稀释的抗菌液加入平皿内。将在 45℃～50℃ 水浴中的双倍浓度营养琼脂培养基 10mL，加进平皿内，边加边摇晃平板，使抗（抑）菌液和培养基充分混匀。  

（5）用加样器取1μL～2μL（含菌量约为 107
cfu/mL 的PBS溶液）菌悬液点种于含抗（抑）菌液培养基的平皿，接种后所形成的菌液圈直径约 5mm～8mm（每个点菌量约为 104cfu）。 

（6）以同样方法接种不含抗（抑）菌成分的营养琼脂平板，作为阳性对照。

（7）将接种后的平板放置 35℃ 恒温培养箱中，倒置培养 18h～24h，观察结果。

4 评价规定 

菌落生长被*抑制的zui低抗（抑）菌液浓度为该样品对受试菌的MIC。单一菌落生长可忽略不计。

5 注意事项 

（1）接种时，应由低抗（抑）菌剂浓度向高浓度平板依次接种，zui后接种对照平板。

（2）为了保证平板受热均匀，培养时平板堆放不得超过4个。