全组织NADH心肌黄酶活性染色试剂盒产品说明书（中文版）

全组织NADH心肌黄酶活性染色试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 全组织NADH心肌黄酶活性染色试剂是一种旨在使用人工电子受体染料二甲基噻唑二苯基四唑嗅蓝（MTT），受到NADH心肌黄酶催化还原，产生不溶性蓝黑*素沉淀，来分析全组织样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心改良传统方法、成功实验证明的。主要适用于各种动物组织的心肌黄酶活性定性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。

技术背景

心肌黄酶（Diaphorase），又称为硫辛酰胺脱氢酶（lipoamide dehydrogenase），黄递酶，二氢硫辛酰胺脱氢酶（dihydrolipoamide dehydrogenase），二氢硫辛酸脱氢酶（dihydrolipoyl dehydrogenase）等。因早期从猪心肌中提取，产品又呈现荧光的黄绿色蛋白质，故被称为心肌黄酶。分子量102000至110000。NADH心肌黄酶直接和黄素蛋白（Flavoprotein）反应，释放出氢原子，将氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）还原为还原型黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2），传递氢原子给氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），而形成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），作为电子供体，还原人工电子受体，例如染料四氮唑兰（tetrazolium）化合物，包括硝基蓝四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT）和二甲基噻唑二苯基四唑嗅蓝（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide；MTT），产生不溶性甲暨色素，由此用于鉴别内脏神经组织等各种动物组织。

产品内容

 清理液（Reagent A）  250毫升

 染色液（Reagent B）   30毫升

 反应液（Reagent C）    3毫升

 固着液（Reagent D）   30毫升

产品说明书    1份

保存方式

保存 染色液（Reagent B）和 反应液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于工作液配制的容器

培养箱：用于反应孵育

光学显微镜：用于染色后切片观察分析

实验步骤

染色开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下融化；移取2.7毫升 染色液（Reagent B）到新的15毫升锥形离心管，加入300微升 反应液（Reagent C），混匀后，标记为 染色工作液，置于冰槽里，避免光照。然后进行下列操作。

• 准备1个6孔细胞培养板
• 放进新鲜切除的动物组织样本（注意：建议组织大小为0.5厘米厚，1厘米长；如果过大，刀切处理一下）
• 将组织压平
• 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），清洗组织样本
• 小心抽去清理液
• 小心加入3毫升 染色工作液，浸没整个组织
• 放进37℃培养箱，孵育60分钟，避免光照
• 小心抽去 染色工作液
• 小心加上3毫升 清理液（Reagent A），清洗组织样本
• 小心抽去清理液
• 重复实验步骤9至10二次
• 小心加入3毫升 固定液（Reagent D），浸没整个组织
• 在室温下孵育15分钟
• 小心抽去固定液
• 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），清洗组织样本
• 在室温下孵育15分钟
• 小心抽去清理液
• 重复实验步骤15至17二次
• 后续石蜡切片（6微米厚）或冰冻切片（10微米厚）
• 在光学显微镜下观察和计数：表达NADH心肌黄酶的组织细胞为阳性组织细胞，呈现蓝黑色

注意事项

• 本产品为10次操作
• 操作时，须戴手套
•  反应液（Reagent C）避免反复冻融
• 阴性对照时， 染色工作液不含有 反应液（Reagent C）
• 心肌组织可以用于阳性对照
• 用户根据实际需求，按比例配制试剂用量
• 整个操作，在避光状态下进行
• 染色孵育时间，根据样品和酶活性强弱调整，通常为60分钟
• 全组织染色存在其染色不均匀、组织内部染色渗透困难等局限
• 染色后的后续处理的切片样品可以长期保存，同样须避免光照
• 染色参考图像见下图

• 本公司提供NADH心肌黄酶活性NBT染色试剂产品
• 本公司提供系列组织细胞酶活性染色试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定显色清晰