活体细胞线粒体膜通道孔（MPTP）荧光检测试剂盒产品说明...

活体细胞线粒体膜通道孔（MPTP）荧光检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 活体细胞线粒体膜通道孔（MPTP）荧光检测试剂是一种旨在通过钙黄绿素－钴技术，选择性地聚集在线粒体内呈现荧光染色，而存在于或由线粒体释放到细胞浆的荧光染料，即刻发生荧光淬灭，来分析和观察线粒体膜通道孔活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种活体细胞线粒体（动物、人体、昆虫等）膜通道孔活性（瞬时或长期开放状态）的检测。产品严格无菌，即到即用，活体检测，分辨率高，操作简捷，性能稳定。

技术背景

线粒体膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由线粒体内外膜成分构成的非特异性且钙离子依赖性通道。在细胞凋亡或坏死时，线粒体内容物通过膜通道孔释放到胞浆中。膜通道孔的开放，显著改变线粒体的通透性。钙离子过度进入、线粒体谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等导致膜通道孔的持续开放，而造成细胞色素C的释放和线粒体膜电位的消失。钙黄绿素-AM，又称双甲亚胺二乙酸钠荧光素－乙酰氧基甲基酯【bis（bis-carboxymethyl amino methyl fluorescein）-acetoxymethyl ester】，作为荧光探针：*，适宜的分子量622kd，小于1.5kd；第二，几乎不具有膜结合性；第三，不是线粒体酶的底物；第四，容易进入细胞及其线粒体。钙黄绿素-AM进入细胞后，被细胞内酯酶切离，产生具有极性的荧光性强的钙黄绿素。钙黄绿素进入线粒体后，被线粒体俘获。同时胞浆内的钙黄绿素受到其淬灭剂钴离子的淬灭。一旦线粒体膜通道孔瞬时开放，钙黄绿素释放出来，被钴离子淬灭。线粒体内钙黄绿素荧光的变化，表明膜通道孔的开放状态。

产品内容

 清理液（Reagent A） 100毫升

 染色液（Reagent B） 100微升

 中和液（Reagent C）  10毫升

产品说明书   1份

保存方式

保存 染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

24孔细胞培养板：用于贴壁细胞染色的容器

1.5毫升离心管：用于染色工作液配制和细胞染色的容器

微型台式离心机：用于沉淀细胞

培养箱：用于染色孵育

（共聚焦）荧光显微镜：用于细胞荧光分析

荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于细胞荧光定量分析

细胞流式仪：用于细胞荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的 染色液（Reagent B）置入冰槽里融化， 中和液（Reagent C）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出5微升 染色液（Reagent B）到新的1.5毫升离心管，加入500微升 中和液（Reagent C），混匀后，标记为 染色工作液，置入暗室里。然后进行下列操作。

• 贴壁细胞染色

• 准备1个细胞培养24孔板的待测细胞（注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和其它培养孔板，见注意事项8）
• 小心抽去细胞培养液
• 小心沿着孔壁加入500微升37℃预热的 清理液（Reagent A）到1个细胞培养孔，覆盖培养孔表面
• 小心抽去清理液
• 小心沿着孔壁加入500微升含有 染色液（Reagent B）和 中和液（Reagent C）的 染色工作液到1个细胞培养孔，覆盖培养孔表面
• 放进37℃细胞培养箱里孵育20分钟，避免光照
• 小心抽去 染色工作液
• 小心沿着孔壁加入500微升37℃预热的 清理液（Reagent A）到细胞培养孔
• 小心抽去清理液
• 重复实验步骤8和9一次
• 小心沿着孔壁加入500微升37℃预热的 清理液（Reagent A）到细胞培养孔
• 选择下列方式之一进行操作：

（A）使用倒置荧光显微镜观察（定性检测）：

激发波长488nm，散发波长505nm――绿色荧光减弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

• 使用荧光酶标仪检测（定量检测）：

放进荧光分光光度仪：激发波长488nm，散发波长505nm――RFU降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

• 悬浮细胞或脱离细胞染色

• 将悬浮细胞或脱离细胞（1 X 10⁶细胞）移入到1.5毫升离心管
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升37℃预热的 清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升含有 染色液（Reagent B）和 中和液（Reagent C）的 染色工作液，充分混匀 
• 放进37℃细胞培养箱里孵育20分钟，避免光照
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升37℃预热的 清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 重复实验步骤11至13一次
• 加入500微升37℃预热的 清理液（Reagent A），混匀细胞颗粒群
• 选择下列方式之一进行操作：
  • 进行细胞流式仪分析（每隔5分钟检测一次，持续30分钟）：波长488nm氩离子激光，观察50000个细胞以上――

波峰左移，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

• 或使用（共聚焦）荧光显微镜观察（定性检测）：

1）移取10微升上述细胞悬液到载波片上，盖上盖玻片（每隔5分钟检测一次，持续30分钟）

2）激发波长488nm，散发波长505nm――

绿色荧光减弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

• 或使用荧光分光光度仪检测（定量检测）：

1）移取500微升上述细胞悬液到1毫升比色杯

2）加入500微升 清理液（Reagent A）

3）上下倾倒混匀数次

4）放进荧光分光光度仪（每隔5分钟检测一次，持续30分钟）：激发波长488nm，散发波长505nm――

RFU降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增强

注意事项

• 本产品为20次（0.5毫升体系/次）操作
• 操作时，须戴手套
• 操作时，避免污染母液
• 染色前，所有试剂溶液，除 染色液（Reagent B）外，需37℃预热
• 建议细胞染色完成后，即刻进行荧光检测分析
• 孵育时，必须避免光照
• 本产品友好使用于双重染色或重叠染色
• 本产品适合各种规格的培养细胞：载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和各种培养孔板，须相应调整处理液：

• 如果不具备505nm散发波长的滤波器，可以使用505nm至530nm中的任一波长
• 如果黑色96孔板的背景读数过高，可以选择530nm散发波长
• 如果膜通道孔为瞬时开放（transient），则荧光缓慢且自发降低
• 本公司提供膜通道孔抑制剂：  0.2毫摩尔环胞素A（cyclosporine A）－GMS12226，维护荧光完整
• 本公司提供系列线粒体分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定荧光清晰