DNA损伤测试盒中文版说明书

DNA损伤测试盒中文版说明书

（货号：MB1189  彗星法）

一、测定意义：

DNA在自由基（如·OH）的攻击下容易发生损伤，即脱氧戊糖遭到破环，磷酸二脂键的断裂，碱基的破环或脱落，便可进一步产生单链断裂或双链断裂。将细胞固定于低熔点琼脂糖中，取少量细胞涂在载玻片上，用碱高盐溶液破坏细胞膜，再用碱溶液使DNA分子解旋。将载玻片置于电泳液中，在电场的作用下，DNA分子向阳极移动。如果DNA损伤严重，碎片多，则电泳速度快。未受损伤的DNA大分子则由于细胞膜的阻隔，滞留在原处。用PI染色或银染，可观察到DNA受损的细胞形同彗星现象，作定性分析。也可用相关的软件作定量分析。

二、试剂盒组份：

三、所需仪器及自备试剂：

低速离心机、水平电泳仪、荧光显微镜、37℃和45℃恒温水浴箱、载玻片、盖玻片、平皿、微量移液器、1.5ml Microtube、0.4mmol/L Tris-HCl（pH7.5）缓冲液、PBS

四、注意事项：Propidium Iodide（PI）和EB有毒，操作时要戴手套。

五、操作步骤：

   1、细胞用冰冷的PBS洗一次，离心收集，用PBS重悬使其密度为1x10⁶个/ml；

   2、铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS配制，

      第1层凝胶的制备：将载玻片的磨砂面向上，45℃预热，将预热45℃的100μl的0.5%正常熔点琼脂糖（NMA）铺于载玻片上，盖上干净的盖玻片，再置4℃下10min使NMA凝固。

第2层凝胶的制备：将10μl细胞（约10⁴个）和75μl的0.7%低溶点琼脂糖LMA（在37℃下水浴加热至少20min使之*溶化）混合均匀。然后，轻轻揭去盖玻片，迅速将含细胞的LMA滴到第1层琼脂糖上，立即盖上另一干净盖玻片，置4℃10min使第2层LMA凝固。

第3层凝胶的制备：第2层LMA凝固后，在室温下小心移去盖玻片，滴加预热37℃的75μl的0.7%低溶点琼脂糖LMA，如上盖上盖玻片4℃下凝固（第三层覆盖第二层周围0.5mm,增加凝胶化作用时间至30min，高湿度环境）。

3、细胞裂解：移去盖玻片，将玻片置于平皿中，倒入预冷的Lysis Bufffer（使用前每9ml加入1ml的DMSO），4℃裂解1～2h，取出载玻片用PBS漂洗。

4、DNA碱解旋：将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的碱性电泳缓冲液（用户自备1mmol/L EDTA，300mmol/L NaOH），约覆过载玻片胶面0.25cm左右，室温放置20～60min,以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA断链在电场中易于迁移。

5、单细胞电泳：在电压25V，电泳20～30min，电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节。

6、中和与染色：电泳后将载玻片置于平皿内。加入0.4mmol/L Tris-HCl（ph7.5）缓冲液，将载玻片没入，4℃中和三次，每次10min，弃去Tris-HCl缓冲液，每载玻片加20μl的PI染液或EB染液，盖上盖玻片，避光染色10min。

7、观察、拍照和分析：荧光显微镜515～560nm波长的激发光、PI染色的DNA图象呈红色，EB染色的DNA图象呈桔红色，可清楚地观察到核DNA和迁移的DNA（即慧星尾）。每个样本随机选择100个细胞，测定核DNA直径和DNA迁移的长度，可并用相应的软件分析。

DNA损伤按慧星尾部DNA量占全部DNA量的比例分为5级：

0级：        ＜ 5%             无损伤；

1级：       5 ～20%          轻度损伤；

2级：       20～40%          中度损伤；

3级：       40～95%          高度损伤；

4级：       ＞ 95%           重度损伤。