细胞尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂（uPA）活性比色法定量检测试剂盒

细胞尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂（uPA）活性比色法定量检测试剂盒

产品说明书（中文版）

主要用途

 细胞尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂（uPA）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过三肽化合物底物p-ERG-pNA受到尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂的水解，释放黄色对硝基苯胺，产生吸光峰值的变化，即采用比色法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体等）尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂（uPA）的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂（urokinase-type Plasminogen Activator；uPA；EC3.4.21.73），又称为尿激酶（urokinase；UK），属于丝氨酸蛋白酶，存在于血液、细胞外基质和尿液中。尿激酶由411氨基酸构成，分子量为54KD，有3个结构域：丝氨酸蛋白酶结构域、kringle结构域和生长因子结构域。其主要的生理性底物为纤维蛋白溶酶原（Plasminogen），即纤维蛋白溶酶（plasmin）的酶原形式（zymogen），切离部位为Cys-Pro-Gly-Arg⊥Val -Val-Gly-Gly-Cys。一旦切离后激活，纤维蛋白溶酶参与细胞蛋白水解过程，包括血栓溶解（thrombolysis）和细胞外基质降解等。uPA与组织重构、修复、血管形成（angiogenesis）性疾病和肿瘤扩散有关。uPA的抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpins），即纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂（Plasminogen Activator Inhibitor；PAI）。基于人工合成的三肽化合物底物p-EGR-pNA（pyro-Glu-Gly-Arg-p- Nitroaniline；焦谷氨酸酰甘氨酰精氨酰对硝基苯胺）受到尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂的水解，释放有色对硝基苯胺，在分光光度仪（405nm 波长）下，测定吸光峰值的变化，来定量测定尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂的活性。其反应系统为：

uPA

p-EGR-pNA-HCl       →          p-EGR-OH  +   pNA

                                （黄色）

产品内容

 清理液（Reagent A） 120毫升

 裂解液（Reagent B）  10毫升

 缓冲液（Reagent C）   2毫升

 阴性液（Reagent D）     1毫升

 底物液（Reagent E）   220微升

产品说明书      1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里； 底物液（Reagent E）避免光照和反复冻融；有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

1.5毫升离心管：用于样品制备和储存的容器

细胞刮脱棒：用于细胞脱离

微型台式离心机：用于样品沉淀

培养箱：用于反应物孵育

96孔板或100微升1厘米光径比色皿：用于样品比色测定的容器

酶标仪或分光光度仪：用于样品比色分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的 底物液（Reagent E）置入冰槽里融化，避免光照。然后进行下列操作。

• 样品制备

• 准备好75cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁷细胞）
• 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），覆盖生长表面
• 小心抽去清理液
• 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
• 加入3毫升 清理液（Reagent A），混匀细胞
• 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 裂解液（Reagent B），充分混匀
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于冰槽里孵育30分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测定准备

• 准备好上述制备的待测样品
• 设定好分光光度仪或酶标仪（温度为37℃）：波长405nm，并置零

• 活性测定

• 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取85微升 缓冲液（Reagent C）到相应孔里
• 分别加入5微升 阴性液（Reagent D）或上述制备的待测样品（50微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
• 分别加入10微升 底物液（Reagent E）
• 轻轻摇动96孔板（注意：避免气泡）
• 在37℃温度下孵育60分钟（注意：可见反应孔里呈现肉眼可见的黄色）
• 即刻放进酶标仪检测或转移到100微升比色皿，在分光光度仪里检测
• 活性计算：

• 酶标仪检测

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.10（毫升，测定容量）]÷[0.005（样品容量，毫升）X 10.5（毫摩尔吸光系数）X 60（分钟）X 0.6（厘米）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔对硝基苯酚/分钟

• 比色皿检测

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.10（毫升，测定容量）]÷[0.005（样品容量，毫升）X 10.5（毫摩尔吸光系数）X 60（分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔对硝基苯酚/分钟

注意事项

• 本产品为21次操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品须澄清，且避免反复冻融
• 测定值由低到高变化；测定可持续60分钟
• 比色测定后，比色皿须清洗*
• 样本测定60分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升；如果样本酶活性过低，则可以延长反应孵育时间至16小时；其次增加样本量（本公司提供   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂单位活性定义为：在37℃，pH 7..5条件下，每分钟内能够切离1微摩尔三肽化合物底物p-ERG-pNA所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列细胞蛋白酶学检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感