纯化线粒体呼吸控制率（RCR）定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

 纯化线粒体呼吸控制率（RCR）定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 纯化线粒体呼吸控制率（RCR）定量检测试剂是一种旨在通过极谱法检测系统（polarographic system）测定新鲜活体线粒体在ADP存在（III态呼吸）与否（IV态呼吸）的情况下溶解氧（dissolved oxygen）的消耗差异，即呼吸控制率（RCR），以评价线粒体结构和功能完整性以及氧化磷酸化效率的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。可以被用于线粒体生理功能和药物作用机制等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。

技术背景

线粒体是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心。电子传递和ATP合成通过质子梯度偶联成一体。线粒体结构完整，功能正常，底物充分，电子传递形成的质子梯度不断被消耗，电子得以顺畅传递，氧气快速消耗，其耗氧率大，为III态呼吸。ADP耗竭，质子梯度不能消耗，阻碍电子传递，氧气消耗减少，为IV态呼吸。 呼吸控制率（respiratory control ratio或respiratory control index；RCR），又称呼吸调节比，是指III态（加入ADP）的呼吸速率与IV态（ADP耗竭）的呼吸速率之比。正常线粒体的RCR为3至10：RCR降低意味着线粒体ATP合成功能损伤，呼吸障碍；RCR增高意味着细胞活动旺盛，代谢加快。

产品内容

 介质液（Reagent A）      50毫升

  IV态底物液（Reagent B）     400微升

  III态底物液（Reagent C）     400微升

产品说明书  1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

CLARK氧电极仪：用于测定溶解氧浓度

实验步骤

实验开始前，制备好新鲜的线粒体置于冰槽里备用；同时将－20℃冰箱里的试剂融化，并预热氧电极仪到25℃。然后进行下列操作。

• 加入2.5毫升 介质液（Reagent A）到反应玻璃槽
• 使用微型磁力子搅拌，充分混匀
• 密封反应槽
• 开始记录氧浓度：起始饱和氧浓度值为0.240微摩尔分子氧/毫升（25℃）
• 持续记录1分钟后，注射加入20微升待测的线粒体（总量2毫克）（注意：氧浓度可能瞬时变化）
• 持续记录1分钟后，注射加入20微升  IV态底物液（Reagent B）――开始IV态呼吸（注意：参见注意事项9）
• 持续记录2分钟：出现氧浓度缓慢下降
• 继续注射加入20微升  III态底物液（Reagent C）（注意：氧浓度在10秒钟内开始下滑）――开始III态呼吸（注意：参见注意事项9）
• 持续记录直至出现线性下行斜线出现拐点
• 分别测算III态呼吸速率和IV态呼吸速率：氧浓度降低值÷实际时间（分钟）
• 计算呼吸控制率：III态呼吸速率÷IV态呼吸速率

注意事项

• 本产品为20次操作
• 操作时，须戴手套
• 确保反应玻璃槽洁净，密闭，以免氧气流入
• 线粒体样品须新鲜制备，建议不要冻存；制备的线粒体膜须完整，非常重要；建议使用 线粒体分离试剂盒－GMS10006.1
• 注射加入反应槽时，避免气泡和空气注入
• 避免乙醇污染；乙醇增加氧浓度；如果底物或抑制剂须使用乙醇溶解，则加注10微升
• 保持反应槽温度恒定，温度降低，氧浓度升高
• 反应液充分混匀，和环境氧保持平衡
• 加注  IV态底物液（Reagent B）和  III态底物液（Reagent C）前，须充分冻融和混匀
• 严格按照规定加注试剂，切莫增加加注试剂容量
• 本公司提供系列线粒体检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感