用PCR扩增cDNA库中的特异序列

zui常用的基因分离方法需要建立组织或细胞RNA的cDNA库，然后用抗体或 DNA探针筛选出感兴趣的基因。虽然这个方法已成功地克隆了大量基因，但建立和筛 选CDNA库是一项非常耗时．费力的工作，而且用寡聚核苷酸作探针进行筛选需大量蛋 白质序列结构的资料。聚合酶链的反应（PCR）方法可使一种特异DNA扩增几百万倍， 并已成为分子克隆和诊断的十分有用的工具。zui近，TAQDNA聚合酶的使用极大地简化 了PCR方法。该酶在75℃左右有很宽的zui适温度区，在小于95℃以下重复保温仍能存 活，更重要的是，该酶活性高，无外切酶活性，因此理论上不用通过建立和筛选基因 库的所用步骤就能从序列编码的基因作模板以探索一种简单．快速的基因分离方法。 下面我们将描述在鉴定南美蝙蝠唾液腺外分泌蛋白中使用的方法和过程。
Dr.S.Gardell(MSDRL，WestPoint，PA)纯化了从南美蝙蝠唾液腺中分离的一种外 分泌蛋白，因此其部分肽序列(GlyLeuGlyCysAspLeuMet)是开始本实验的关键。为检 验不用传统筛选方法即能克隆该蛋白基因的假说，我们采取了如下策略:

a).在Lambdagt22中建立一个在蝙蝠唾液腺中所有转录子的cDNA库，并在边侧加 上SP6、T6聚合酶启动子，这样可以直接用两种启动子序列之一作引物进行扩增和测 序。

b).合成四组引物，组合起来代表已知的部分蛋白序列的全部有效密码子组合 (1024种衍生列)。C).这些引物与适当的T7或SP6聚合酶序列引物组合成对，以总cDNA 库作模板，进行pcr扩增。所得到PCR产物应该代表编码该蛋白的部分cDNA。对这些 PCR产物直接测序应能得到足的序列信息以合成同源引物，进一步进行PCR扩增，产生 的DNA片段结合起来可给出编码该蛋白的cDNA的完整序列。

直接用2%琼脂糖凝胶分析PCR产物，组混合引物