精子细胞氧化应激活性氧（ROS）NBT比色法定量检测试剂盒

精子细胞氧化应激活性氧（ROS）NBT比色法定量检测试剂盒产品说明书

（中文版）

主要用途

 精子细胞氧化应激活性氧（ROS）NBT比色法定量检测试剂是一种旨在通过硝基蓝四氮唑染料，受到超氧阴离子O₂^-的还原，产生不溶性蓝黑色色素沉淀，由分光光度仪比色分析，定量检测精子细胞内活性氧族的生成和增加的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适用于动物和人体精子细胞的活性氧族的检测。可以被用于细胞凋亡、衰老、代谢和营养学，以及发育生物学（男性不育）等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，显色清晰。

技术背景

超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2^-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH^-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，甚而导致诸如男性不育、冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。其中精子细胞（spermatozoa）对于活性氧较为敏感：低浓度活性氧可以调节正常精子功能、精子获能、顶体反应、精卵融合等；高浓度活性氧则影响精子细胞的质量和功能，因为精子细胞质膜含有大量不饱和脂肪酸，胞浆含有少量的祛除活性氧的相关酶蛋白，由此活性氧容易造成精子质膜的流动性和DNA完整性受到损害，精子运动能力降低，不能参与授精活动，zui终导致特发性不育症（idiopathic infertility）。染料四氮唑兰（tetrazolium）化合物，硝基蓝四氮唑（Nitro Blue Tetrazolium；NBT），是一种黄色水溶性硝基替代性芳香族四氮唑化合物，与细胞内超氧阴离子O₂^-反应而被直接还原，产生不溶性甲暨色素，在分光光度仪下（650nm波长），呈现吸光峰值的变化。据此定量检测精子细胞内氧化应激活性氧族的浓度。

产品内容

 清理液（Reagent A）    500毫升

 染色液（Reagent B）      1瓶

 溶解液（Reagent C）     10毫升

产品说明书 1份

保存方式

保存 染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

2毫升离心管：用于样品操作的容器

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

（微型）台式离心机：用于样品操作

细胞培养箱：用于精子细胞染色孵育

96孔板：用于比色分析的容器

酶标仪：用于比色分析

实验步骤

• 样品预处理

• 移取2毫升新鲜收集（1小时内）的精液到2毫升离心管
• 放进37℃培养箱孵育20分钟
• 放进微型台式离心机离心7分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升 清理液（Reagent A），混匀精子细胞颗粒群
• 放进台式离心机离心7分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入适量的 清理液（Reagent A）
• 充分混匀后，在血细胞计数器上进行精子细胞计数
• 调整精子细胞数为1 X 10⁷/毫升
• 放进37℃培养箱里备用（1小时内）

• 样品检测

实验开始前，移出10毫升 清理液（Reagent A）到1瓶 染色液（Reagent B）瓶里，混匀后，标记为 染色工作液，置于冰槽里备用（注意，用完后即刻放回－20℃冰箱里）。然后进行下列操作。

• 移取100微升上述预处理的精子细胞到1.5毫升离心管
• 加入100微升 染色工作液，混匀
• 放进37℃细胞培养箱里孵育45分钟
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为500g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 清理液（Reagent A）
• 放进微型台式离心机离心10分钟，速度为500g
• 小心抽去清理液
• 重复实验步骤6至8一次
• 加入100微升 溶解液（Reagent C），混匀

11． 在室温下，孵育5分钟

12． 即刻转移到96孔板

13． 放进酶标仪测读，波长为650 nm

• 构建精子细胞内活性氧生成曲线：纵座标（Y轴）为活性氧吸光值（OD）；横坐标（X轴）为细胞数、时间点或药物处理浓度等
• 或计算ROS水平：

（样品读数－本底读数） ÷ 0.1（毫升；样品容量） ＝吸光单位（OD） / 毫升＝吸光单位（OD）/1 X 10⁷精子细胞 

注意事项

• 本产品为100次（96孔板）操作
• 操作时，须戴手套
• 孵育时，须避免光照
• 测试前，精子细胞须新鲜收集，1小时内为*
• 精子细胞悬液制备后即刻测读，不宜过夜保存
• 精子细胞悬液须清澈
• 如果需要排除精液白细胞的干扰，建议纯化精子细胞： 精子细胞高纯分离试剂盒（GMS14003）
• 如果需要区分精液各种成分的活性氧生成情况，建议使用 精浆（seminal plasma）氧化应激活性氧（ROS）NBT比色法定量检测试剂盒（GMS14007.2）
• 本产品适合冻存的精子细胞检测
• 如果活性氧浓度过低，可以延长孵育时间至2小时
• 本公司提供系列精子细胞分析试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感