一，C57小鼠BMSCs原代培养

    1，实验前准备好相关手术器械，培养器材及相关试剂PBS平衡缓冲液、10％FBS，IMDM培养基。

    2，脱颈法处死C57小鼠，在75％乙醇中浸泡5min，转移至超净工作台中，无菌条件下分离出小鼠的长骨(股骨和胫骨)，浸泡于PBS溶液中。

3，对股骨和胫骨进行深层次解剖，去除附着的肌肉组织，剪掉长骨两端的干骺端，用10％FBS，IMDM培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔发白，收集洗涤液，用移液枪轻轻吹散分离为单个细胞。

4，细胞接种于六孔板中培养，轻微摇匀，使细胞在孔中均匀分布，放置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养，培养期间不要移动六孔板，使BMSCs充分贴壁。

5，培养48h后换液，用预热的PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2次，添加新鲜培养基，之后每隔48h换液1次。原代培养6-7d后细胞铺满80％(图1)，可进行传代培养。

            图1：BMSCs原代培养6-7d (武汉云克隆诊断试剂研究所)

二，BMSCs成脂诱导分化

BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成脂诱导培养基(IMDM中加入10%FBS，10μg/ml胰岛素，1μM地塞米松，0.5mMIBMX，0.1mM吲哚美辛)。3d换液1次， 分化12d。

待脂滴形成后进行油红O染色，PBS缓冲液清洗3次，10％中性甲醛固定20min，再用PBS缓冲液清洗2次，油红O染液浸染30min，PBS缓冲液清洗2次，苏木素染液浸染1min，弃去染液，倒置显微镜下观察拍照。

成脂诱导分化过程中发现在诱导5d时，细胞形态开始变圆并大量脱落，部分细胞中出现细小脂滴(图2)。

                        图2：BMSCs成脂诱导5d

三，BMSCs成骨诱导分化

BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成骨诱导培养基(IMDM中加入10%FBS,5μg/ml胰岛素，0.1μM地塞米松，0.2mM维生素C和10mM β-甘油磷酸盐)。3d换液1次，分化15d(图3)。

待矿化结节形成后，进行硝酸银染色。PBS缓冲液清洗3次，10％中性甲醛固定20min，再用PBS缓冲液清洗2次，硝酸银染液浸染，于阳光下曝光30min，PBS缓冲液清洗2次，倒置显微镜下观察拍照，可见矿化结节(图4)。

图3：BMSCs成骨诱导分化6d

 图4：BMSCs成骨诱导形成矿化结节