在上期内容里简要介绍了赛默飞Acclaim系列混合模式色谱柱的理化性质、保留机制及典型应用，那么这一期我们将进一步探讨混合模式方法开发过程中的色谱柱选择及色谱条件优化细节。

混合模式方法开发的重点和难点，主要集中在色谱柱选择、流动相选择、检测器选择以及色谱条件优化，接下来我们针对每一个细节进行探讨，并总结一些经验及注意事项，为药物色谱分析提供借鉴和参考。

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色谱柱的选择

根据化合物的理化性质，准确识别分子结构的特征官能团，如苯环、烃链等的疏水官能团，羧酸、磺酸等酸性官能团，胺类、含氮杂环等碱性官能团，多羟基官能团（糖类），强极性化合物及阴阳离子。针对不同类型目标物，Acclaim系列混合模式色谱柱适用范围，如表1所示：

具有反相保留的酸性化合物推荐色谱柱：Acclaim Mixed-Mode WAX-1，Acclaim Trinity P1；

具有反相保留的碱性化合物推荐色谱柱：Acclaim Mixed-Mode WCX-1，Acclaim Trinity P1；

具有多羟基结构的中性化合物推荐色谱柱：Acclaim Mixed-Mode HILIC-1，Acclaim Trinity P2;

强极性化合物推荐色谱柱：Acclaim Trinity P1，Acclaim Trinity P2，Acclaim Trinity Q1；

活性药物成分与对离子分析推荐色谱柱：Acclaim Trinity P1，Acclaim Trinity P2。

表1针对不同类型目标物，Acclaim系列混合模式色谱柱适用范围汇总

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流动相的选择

有机相：除Acclaim Mixed-Mode HILIC-1外，Acclaim系列混合模式色谱柱均涉及离子交换作用，基于洗脱强度及离子交换可控的考量，通常建议有机相使用非质子溶剂——乙腈。对于 Acclaim Mixed-Mode WCX-1，Acclaim Trinity P2 和 Acclaim Trinity Q1具有弱阳离子交换（WCX）功能的色谱柱禁止使用醇类（甲醇、乙醇、异丙醇等）作为样品溶剂或流动相，因为醇类在一定条件下会与羧酸官能团发生酯化反应，导致保留时间漂移。Acclaim Mixed-Mode HILIC-1在分析聚乙二醇PEGs时，可使用甲醇作为有机相；Acclaim Surfactant Plus在分析吐温-80时，可使用异丙醇作为有机相。

水相（缓冲盐）： Acclaim系列混合模式色谱柱在活化、分析或保存的过程中，为避免因电荷无法中和而导致离子交换官能团出现坍塌，因此水相必须含缓冲盐，通常建议使用甲酸铵、乙酸铵或磷酸缓冲盐，缓冲盐种类、浓度及pH调节，应根据化合物理化性质、检测器类型来选定。对于 Acclaim Mixed-Mode WAX-1，和 Acclaim Surfactant Plus 具有弱阴离子交换（WAX）功能的色谱柱在乙腈-10 mM 乙酸铵（pH=5.0）充分过渡后，推荐用 100% 乙腈作为长期储存溶剂。Acclaim Mixed-Mode HILIC-1可使用纯水作为水相。

缓冲盐pH：Acclaim系列混合模式色谱柱耐受pH范围通常为2.5-7.5，推荐使用的pH范围为3.0-6.0，赛默飞实验室通常会在pH=4.0/5.0/6.0三个值进行缓冲盐pH筛选。混合模式下缓冲盐pH较为温和，pH=4.0偏酸性，在Acclaim Mixed-Mode WCX-1分析碱性化合物时，既可以让目标物充分电离，同时不会抑制固定相的羧基官能团；pH=6.0偏碱性，在Acclaim Mixed-Mode WAX-1分析酸性化合物时，既可以让目标物充分电离，同时不会抑制固定相上的叔胺官能团。当分析物质中酸性/碱性化合物同时存在时，可尝试pH=5.0的缓冲盐以兼顾二者的保留。

在混合模式方法开发中，常见的洗脱程序有等度洗脱程序、有机相梯度洗脱程序和缓冲盐梯度+有机相梯度洗脱程序，如图1所示。在洗脱过程中调节有机相-缓冲盐比例时，应尽可能避免出现盐析。

图1在混合模式方法开发中，常见的洗脱程序

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检测器兼容性

与反相C18色谱柱一样，无论是单一键合的Bi-modal，还是纳米聚合物硅胶杂化的Tri-modal，Acclaim系列混合模式色谱柱键合相稳定，柱流失较低，与常见的浓度型检测器（DAD/MWD/VWD/FLD）和质量型检测器（ELSD/CAD/MSD）具有高度的兼容性。化合物有较强紫外吸收时，可选择紫外检测器；化合物有荧光响应时，可选择荧光检测器；化合物在紫外端吸收较弱或无特征吸收时，可选择电喷雾检测器。在使用电喷雾检测器时，应选择挥发性缓冲盐，如甲酸铵、乙酸铵；在使用紫外检测器时，目标物检测波长接近紫外端时，应选择截止波长较低的磷酸缓冲盐。

Acclaim系列混合模式色谱柱与常见检测器的兼容性，如表2 所示。

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选择性 α 的优化

在反相模式下，通过调节选择性 α 来优化分离和保留是最为有效的，而选择性 α 主要受流动相和固定相的影响，因此，调节有机相比例和种类、调节流动相 pH（水相）和改变固定相类型是优化反相分离和保留最常见的三种方法。

在混合模式下，有机相优先推荐使用乙腈，并且缓冲盐浓度对离子交换影响较大，因此，优化混合模式分离和保留的方法有调节离子强度、调节流动相 pH（水相）、调节有机相比例和改变固定相类型，其中调节离子强度和调节有机相比例较为常用。

如图2所示，在Acclaim Mixed-Mode WAX-1色谱柱上，通过调节选择性 α 来优化丁基苯和对羟基苯甲酸的分离和保留；如图3所示，在相同色谱条件下，苯甲酸、萘和苄胺分别在Acclaim Mixed-Mode WCX-1和Acclaim Mixed-Mode WAX-1上表现出不同的选择性。

图2在Acclaim Mixed-Mode WAX-1色谱柱上，通过调节选择性 α 来优化丁基苯和对羟基苯甲酸的分离和保留（点击查看大图）

图3在相同色谱条件下，苯甲酸、萘和苄胺分别在WCX-1和WAX-1上表现出不同的选择性

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如图4和图5所示，在Acclaim Trinity P1色谱柱上，通过调节有机相比例和缓冲盐浓度来优化Na⁺、K⁺、Cl^-和Br^-离子的分离和保留。

图4在Acclaim Trinity P1色谱柱上，通过调节有机相比例来优化Na⁺、K⁺、Cl^-和Br^-离子的分离和保留（点击查看大图）

图5在Acclaim Trinity P1色谱柱上，通过调节缓冲盐浓度来优化Na⁺、K⁺、Cl^-和Br^-离子的分离和保留（点击查看大图）

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方法开发案例分享

羧甲司坦分子结构含两个羧基和一个氨基，pKa=2.06±0.10(Predicted)，属于酸性化合物，因此选择Acclaim Mixed-Mode WAX-1色谱柱。羧甲司坦在近紫外端无特征吸收波长，考虑到其他杂质的响应，检测波长选择215nm，因此缓冲盐须选择截止波长较低的磷酸缓冲盐。最终流动相选定为乙腈-25mM磷酸氢二铵（磷酸调节pH至6.0），并配合梯度洗脱，羧甲司坦与相关杂质可有效分离，峰形良好，柱效优异，分离谱图及数据如图6 所示。

图6 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 应用于羧甲司坦有关物质的测定（点击查看大图）

托吡卡胺分子结构含苯环、吡啶环、酰胺和羟基，经查询化合物 pKa=5.3 (Uncertain)，由于吡啶环是一个典型的碱性结构，并且有关物质中的工艺杂质多为碱性化合物，因此选择Acclaim Mixed-Mode WCX-1色谱柱。流动相缓冲盐选择50mM磷酸氢二铵（磷酸调节pH至4.0），并采用乙腈-水-缓冲盐等度洗脱，托吡卡胺保留时间在8min左右。对照溶液浓度2.0mg/mL，进样量50μL，主峰托吡卡胺并未出现严重过载，表明Acclaim Mixed-Mode WCX-1具有较高的载样量，相关杂质均能有效分离，且灵敏度较好，分离谱图及数据如图7所示。

图7 Acclaim Mixed-Mode WCX-1 应用于托吡卡胺有关物质的测定（点击查看大图）

在阴阳离子Na⁺、K⁺、Cl^-、Br^-、I^-和SO₄^2-的分析中，实验室采用Acclaim Trinity P1色谱柱配合CAD检测器，流动相缓冲盐选择挥发性的乙酸铵，由于二价硫酸根洗脱需要高浓度的缓冲盐，参考早期实验方案的谱图及数据，乙酸铵浓度选定为200mM，用乙酸调节pH至5.0。流动相选择乙腈-水-缓冲盐梯度洗脱，Na⁺ 和K⁺，Cl^- 和Br^-，两组离子分离度良好，分离度分别为2.17和1.71，SO₄^2-在洗脱程序后期90%高浓度缓冲盐的洗脱下，峰宽较窄，峰形优异，不对称因子为1.28，分离谱图及数据如图8所示。

图8 Acclaim Trinity P1 应用于 Na⁺、K⁺、Cl^-、Br^-、I^-、SO₄^2- 的含量测定（点击查看大图）

如需更为详尽的Acclaim系列混合模式色谱柱方法开发资料，可从赛默飞下载色谱柱产品说明及使用指南：

Product Specifications 产品说明

PS22091-EN ：Acclaim Mixed-Mode WAX-1 column: Total Control of Selectivity

PS22092-EN ：Acclaim Mixed-Mode WCX-1 column: For Separating Basic Molecules

PS22090-EN ：Acclaim Mixed-Mode HILIC-1 column: A powerful tool for separating polar molecules

PS22083-EN ：Acclaim Trinity P1 column: Superior pharmaceutical and counterion separations

PS20861-EN ：Acclaim Trinity P2 column: Ideal solution for pharmaceutical counterion analysis

PS20567-EN ：Acclaim Trinity Q1 column: For trace analysis of diquat and paraquat

PS20477-EN ：Acclaim Surfactant Plus column: Performance, versatility, throughput

Product Manual 使用指南

Acclaim Mixed-Mode WAX-1 Columns

Acclaim Mixed-Mode WCX-1 Columns

Acclaim Trinity P1 Product Manual

Acclaim Trinity P2 Product Manual

Acclaim Trinity Q1 Product Manual

Acclaim Surfactant Plus Product Manual

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