产品简介：

辣椒轻斑驳病毒（Pepper Mild Mottle Virus，PMMoV）是一种影响辣椒作物的植物病原性病毒，属于烟草花叶病毒科。该病毒是一种单链正义 RNA 病毒，基因长度约为 6.4 knt。这种病毒在全球范围内对甜椒、辣椒和观赏辣椒品种构成严重威胁，导致产量和品质下降。辣椒轻斑驳病毒的典型症状包括叶片褪绿、发育不良、果实结构扭曲和块状。其传播途径主要包括机械传播和通过受感染的种子传播。由于该病毒一旦感染植物就无法治疗，因此控制这种疾病的最好方法是使用经过病原体检测和处理的种子进行种植。因此快速灵敏诊断辣椒轻斑驳病毒具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测辣椒轻斑驳病毒的含内参试剂盒。

产品特点：

1.即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。

2.引物和探针经过优化，分析灵敏度高，可以达到 100 拷贝/反应。

3.提供阳性对照，便于制备标准曲线和用作扩增对照，排除假阴性结果。

4.含识别内源性内参的引物和探针，便于排除 RT-PCR 假阴性样本。

5.特异性高，靶分子的引物和探针是根据辣椒轻斑驳病毒 RNA 高度保守区设计，不会跟其他生物的 RNA 发生交叉反应。

6.既可用于定性检测，又可用于定量检测。定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。

7.本产品足够 50 次 20 μL 体系的探针法 RT-PCR 反应。

8.辣椒轻斑驳病毒探针法 qRT-PCR 试剂盒只能用于科研。

产品参数：

产品规格

50T/盒，可满足一定规模的检测需求。

检测方法

实时荧光PCR，具有快速、准确、灵敏等优点。

试剂盒成分

探针法 qRT-PCR 缓冲液、探针法 qRT-PCR酶混合液 v2、荧光 PCR 专用模板稀释液、辣椒轻斑驳病毒 qRT-PCR探针法引物-探针干粉、辣椒轻斑驳病毒 qRT-PCR阳性对照(1×10E7 拷贝/μL)、使用手册。

自备试剂

样品 RNA，超纯水，核酸纯化试剂盒。

保存和运输

低温运输，-20℃保存，保存期限为 24 个月。

使用方法：

一、稀释标准曲线样品（以阳性对照 1E1-1E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。

1.标记 6 个离心管，分别为 6、5、4、3、2、1。

2.在各管中加入 45 μL 荧光PCR 专用模板稀释液。

3.在 6 号管中加入 5 μL 1E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头，在 4 号管中加入 5 μL 1E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线阳性样品。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

7.如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是制备 PC（样品制备阳性

对照），一个是制备 NC（样品制备阴性对照）。可以用确认是阳性的样本作为阳性对照，用确认是阴性的样本作为阴性对照。

8.用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数 RNA -提取试剂盒兼容， 也可以选购本公司的核酸-提取试剂。

三、Probe qRT-PCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 RT-PCR 管，其中N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照（用水做模板）， 1 个用于 RT-PCR 阳性对照（直接用第 6 步第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复）：

成分样品管

N+2 个RT-PCR

阴性对照标准曲线样品管

（1-6 管）

探针法 qRT-PCR 缓冲液各 10 μL10 μL各 10 μL

探针法 qRT-PCR 酶混合液 v2各 1 μL1 μL各 1 μL

辣椒轻斑驳病毒 PCR 引物-探针

混合液(含内参引物和探针)各 4 μL4 μL4 μL

N+2 个待测样（含内源性内参）各 5 μL不加不加

超纯水不加5 μL不加

第 6 步所得标准曲线样品稀释液

（含内参，1-6 号）不加不加各 5 μL（2 号样

到 2 号管，3 号样

到 3 号管…）

四、数据处理

12.阴性阳性判断：没有 Ct 读数，或 Ct 大于 40 判为阴性结果。有 Ct 读数，Ct 值小于 40，荧光信号有对数增长，有典型扩增曲线判为阳性结果。每个样本需要对FAM 通道和 Cy5 通道的结果分别进行判定，得到两个结果。

13.实验有效性判断：如果扩增阳性对照或制备阳性对照 FAM 通道结果为阴性则整个实验无效，不需要分析数据，需要分析原因，可能是操作、仪器和试剂三方面的原因，重做扩增或制备或跟仪器和试剂厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照 FAM 通道结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要分析失败原因，直到污染消除。如果阳性对照和阴性对照正常，则进入下一步分析样本的有效性。

14.样本有效性判断：如果样本 FAM 通道的结果为阳性，则无论内参通道的结果是阴性还是阳性，样本的结果均有效。如果样本结果为阴性，内参通道结果也为阴性， 则此样品的阴性结果无效。此样品需要重新提取核酸和进行扩增。

15.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，分别以阳性对照 FAM 通道和内参通道的 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线，阳性对照 FAM 通道读数的标准曲线为斜线，r2 必须大于 0.95，内参通道读数的标准曲线为一条跟 X 轴平行的横线。再以待测样品的 Ct 值从阳性对照FAM 通道读数的标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

16.如果用于定性实验，对待测样品，如果其 FAM 通道的 Ct 没有读数、或 Ct 大于或等于 40 则均为阴性，如果小于 40 则为阳性。对任何 FAM 通道结果为阴性的待测样本，如果其对应的内参通道也为阴性，则此样品的阴性结果无效，此样品需要重复实验。

选择我们的辣椒轻斑驳病毒探针法 qRT-PCR 试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！