产品简介：

艾美球虫属（Eimaria spp.）是一种体内寄生虫，引起各种动物的艾美球虫病。球虫是一种超小型的单细胞原虫类寄生虫，其家族非常庞大。艾美球虫的特点是普通的杀寄生虫的药物对它都无效。此外，球虫的卵囊对恶劣环境和消毒剂抵抗力较强，能够在在土壤中存活长达 4-9 个月。因此艾美球虫可以感染很多动物。虽然如此，球虫对宿主却有严格的选择性，不同种的家畜有不同种的球虫， 互不交叉感染。不同种的球虫又各有其固定的寄生部位它。由于球虫感染多种动物并且难以治疗，因此快速灵敏诊断艾美球虫属具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测艾美球虫属的试剂盒。

产品特点：

1.即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2.引物和探针经过优化，分析灵敏度高，可以达到 100 拷贝/反应。

3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4.特异性高，引物是根据艾美球虫属 DNA 高度保守区设计，不会跟其他生物的 DNA 发生交叉反应。

5.涵盖性好，可以扩增艾美球虫属的大多数种。包括柔嫩艾美耳球虫（E. tenella）、E. vermiformis、堆型艾美耳球虫（E. acervulina）、巨型艾美耳球虫（E. maxima）、和缓艾美耳球虫（E. mitis）、和缓艾美耳球虫

（E. praecox）、E. pragensis、毒害艾美耳球虫（E. necatrix）和布氏艾美耳球虫（E. brunetti）。

6.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5各数量级。

7.本产品足够 50 次 20 μL 体系的探针法 qPCR 反应。

8.艾美耳球虫属通用探针法荧光PCR试剂盒只能用于科研。

产品参数：

产品规格

50T/盒，可满足一定规模的检测需求。

检测方法

实时荧光PCR，具有快速、准确、灵敏等优点。

试剂盒成分

2×Probe qPCR MasterMix、荧光 PCR 专用模板稀释液、超纯水、艾美耳球虫属通用 qPCR 引物-探针干粉、艾美耳球虫属通用qPCR 阳性对照(1E7 拷贝/μL)、使用手册。

自备试剂

样品 DNA，超纯水，核酸纯化试剂盒。

保存和运输

低温运输，-20℃保存，保存期限为 24 个月。

使用方法：

一、稀释标准曲线样品（以 1E1-1E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由

于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。如果需要 RNA 阳性样品，需要另外订购。

1.标记 6 个离心管，分别为 6、5、4、3、2、1。

2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3.在 6 号管中加入 5 μL 1E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1

分钟，得 1E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头，在 4 号管中加入 5 μL 1E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7.如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性

对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10 μL 上步所得 4 号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为 NC。

8.用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA- 提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的核酸-提取试剂。

三、Probe qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR

管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（直接用第 6 步第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分样品管

N+2 个PCR 阴性

对照标准曲线样品管

（1-6 管）

2×Probe qPCR MasterMix各 10 μL10 μL各 10 μL

艾美球虫属通用qPCR

引物-探针混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

N+2 个待测 DNA 样本各 7 μL不加不加

超纯水不加7 μL不加

第 6 步所得标准曲线样品稀释液

（1-6 号）

不加

不加各 7 μL（2 号样到 2 号管，3

号样到 3 号

管…）

四、数据处理

12.如果样本制备阳性对照或PCR 阳性对照(包括标曲样本)结果为阴性，则整个实验无效，不需要分析数据，需要重新样本制备，重新进行 PCR 扩增或跟厂家联系。如果样本制备阴性对照或 PCR 阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系。

13.如果阴性对照和阳性对照均正常，则实验有效，可以进入后续分析。

14.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

15.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无 Ct 或Ct 大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于 40，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无 Ct或 Ct 大于或等于 40，则为阴性。如果 Ct 小于 40 则为阳性。

选择我们的艾美耳球虫属通用探针法荧光PCR试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！