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杭州实了个验生物科技有限公司
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什么是实时荧光定量PCR仪
2025-3-18 阅读(94)
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一、引言
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种在体外扩增特定DNA片段的技术。自1983年诞生以来，PCR技术在生命科学研究、医学诊断、环境监测、食品安全、法医鉴定等领域得到广泛应用。随着分子生物学的发展，传统PCR已逐渐无法满足对灵敏度、准确性、定量能力的更高需求。因此，实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR）应运而生。
实时荧光定量PCR仪是一种结合荧光探针或染料信号，实现DNA扩增与实时检测的高通量分子检测设备。本文将围绕其基本原理、仪器结构、工作流程、数据分析、技术优势及应用等方面进行系统介绍。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
1. 核酸扩增原理
实时荧光定量PCR与传统PCR的基本扩增机制相同，均基于三步循环：
变性（Denaturation）：高温使双链DNA分离为两条单链；
退火（Annealing）：降低温度，使引物结合到模板DNA上；
延伸（Extension）：DNA聚合酶延伸引物，合成新的DNA链。
每个循环都会使目标DNA数量翻倍，经过30~45个循环后即可获得大量扩增产物。
2. 荧光定量原理
实时PCR通过加入荧光标记物，在每一轮扩增过程中同步检测荧光强度的变化，从而反映DNA的累积量。其定量方式主要有两种：
染料法（如SYBR Green）：染料可与双链DNA结合并发出荧光，随DNA浓度增加荧光增强。
探针法（如TaqMan探针、MGB、Molecular Beacon）：通过序列特异性探针的荧光信号变化监控扩增，特异性更高。
荧光信号被检测器记录，绘制出扩增曲线，从而实现定量分析。
三、仪器结构与功能模块
实时荧光定量PCR仪主要由以下几个部分组成：
1. 热循环模块
负责提供精确的温控环境，确保PCR扩增反应的温度条件，包括变性、退火、延伸及熔解过程。该模块通常采用半导体控温系统，温度控制精度在±0.1℃以内。
2. 光学检测系统
包含激发光源、滤光片、光路系统和荧光检测器。激发光源（如LED或激光器）激发荧光染料，荧光信号通过滤光片传输到CCD或光电倍增管进行记录。多通道检测系统可同时监控多种荧光信号，用于多重PCR反应。
3. 控制与分析软件
用于实验设置、数据采集、扩增曲线分析、Ct值计算、标准曲线建立、熔解曲线绘制等。软件界面通常具备参数可视化、结果导出、模板管理等功能。
4. 样本模块
样本通常装载于96孔、384孔或较小通量的反应板、管条中，有些仪器还支持快热系统以缩短反应时间。
四、工作流程
1. 样本准备
提取目标样本中的DNA或RNA（RNA需逆转录为cDNA），并准确定量。引物与探针设计需依据目标序列，避免二聚体和非特异性结合。
2. 配制反应体系
一般包括以下成分：
DNA模板
上下游引物
荧光染料或探针
PCR缓冲液、Mg²⁺、dNTPs
热启动DNA聚合酶
3. 设置程序参数
包括初始变性时间、循环次数、各阶段温度与时间、熔解曲线分析等。染料和探针类型不同可能需要调整检测通道。
4. 实验运行与数据采集
仪器自动完成循环扩增和荧光信号采集，实验结束后通过软件分析数据，获取Ct值、Tm值、扩增效率等信息。
五、Ct值与定量原理
1. Ct值定义
Ct（Cycle threshold）值是指荧光信号超过背景阈值所对应的扩增循环数。Ct值越小，代表初始模板浓度越高。
2. 相对定量与绝对定量
相对定量：使用内参基因作为对照，计算目标基因的表达变化，常用2^-ΔΔCt方法。
绝对定量：通过标准曲线法，根据Ct值与模板拷贝数的对数关系，精确测量未知样本中目标基因的拷贝数。
六、与传统PCR的比较
| 项目 | 传统PCR | 实时荧光定量PCR |
|---|---|---|
| 检测方式 | 电泳后检测 | 实时荧光检测 |
| 是否定量 | 否 | 是 |
| 灵敏度 | 中 | 高 |
| 特异性 | 依赖引物设计 | 探针法特异性更高 |
| 时间成本 | 较长（需电泳） | 较短（无需后处理） |
| 数据输出 | 定性结果（条带） | 定量曲线和Ct值 |
七、常见问题与解决策略
1. 非特异性扩增
可能由引物设计不当、退火温度过低或引物浓度过高引起，可通过优化退火温度、重新设计引物、调整引物浓度解决。
2. 引物二聚体产生
主要表现为熔解曲线出现低Tm值小峰，通过使用热启动酶、优化引物设计或调整PCR体系浓度可缓解。
3. 荧光信号弱
可能由反应体系抑制、模板降解或引物效率低导致，需检查模板质量，优化引物或提高反应体系兼容性。
4. 多重通道串扰
应校准滤光片组或检测通道，确保荧光染料之间不发生交叉干扰。
八、技术应用领域
1. 基因表达分析
通过检测不同处理、组织或时间点中基因的表达量变化，广泛应用于转录调控、信号通路研究等。
2. 病原体检测
利用qPCR高灵敏度，可快速检测病毒、细菌、真菌等病原体DNA/RNA，广泛用于临床诊断与疫情监测。
3. 基因分型与突变分析
通过Tm值变化或探针结合位点识别不同等位基因，用于SNP检测、遗传多态性研究。
4. 转基因筛查
针对转基因作物中特定外源基因序列进行检测，可实现定量检测与溯源追踪。
5. 微量核酸检测
适用于循环DNA（cfDNA）、微量残留病毒等极低拷贝数样本的检测，配合数字PCR可进一步提高分辨率。
九、发展趋势与技术创新
随着分子诊断、个体化医疗等领域的发展，实时荧光定量PCR技术也不断演进，呈现出以下趋势：
自动化：集成样本制备、扩增和检测，提高实验效率。
便携化：发展移动式实时PCR设备，适应现场检测需求。
高通量：支持384孔板、多通道检测，提高数据产出。
精准分析：与数字PCR、高分辨率熔解曲线（HRM）技术结合，拓展应用边界。
十、结语
实时荧光定量PCR仪通过结合热循环扩增技术与荧光信号监测系统，实现了DNA扩增的实时、定量分析，为科研、医学、农业、司法等多个领域提供了强有力的技术支撑。其高灵敏度、稳定性和数据可追溯性，使其成为现代分子生物学实验中的常用工具。未来，随着自动化与智能化水平的提升，实时PCR技术将在更多场景中发挥作用。
