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杭州实了个验生物科技有限公司
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赛默飞实时荧光定量pcr仪测定Tm值
2025-3-18 阅读(117)
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一、引言
聚合酶链式反应（PCR）是一种广泛应用于分子生物学、医学诊断、食品安全和环境检测等领域的核酸扩增技术。实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR, qPCR）在传统PCR的基础上引入了荧光探针或染料，使得反应进程可以实时监测。熔解温度（Tm，Melting Temperature）作为核酸双链解链过程中的一个关键参数，能够为引物特异性分析、突变检测、产物鉴别等提供重要依据。
赛默飞科技生产的实时荧光定量PCR仪因其灵敏度、通量和数据分析能力，在多个实验室中得到广泛使用。本文将详细介绍如何利用赛默飞实时荧光定量PCR仪进行Tm值的测定，并探讨该过程的技术原理、实验步骤及其应用价值。
二、Tm值的基本概念与意义
熔解温度（Tm值）是指双链DNA变性为单链时的温度，此时有50%的双链DNA分子解链。Tm值受DNA序列长度、GC含量、离子浓度、DNA浓度等因素影响。测定Tm值对于以下方面具有重要意义：
引物和探针设计优化：确保扩增的特异性和效率。
产物鉴别：通过熔解曲线识别不同的扩增产物或杂交探针的结合差异。
SNP和突变检测：通过微小Tm值差异区分单核苷酸变异。
验证扩增特异性：避免非特异性扩增对结果造成干扰。
三、仪器原理与检测机制
赛默飞的实时PCR系统通常采用SYBR Green I或TaqMan探针等荧光标记方式来监测DNA扩增。对于Tm值测定，多采用SYBR Green染料，其在双链DNA存在时发出荧光，单链时荧光迅速降低。通过逐步升温并记录荧光变化，即可绘制出熔解曲线，进一步计算Tm值。
仪器通过以下机制测定Tm值：
荧光信号采集：在升温过程中持续监测SYBR Green的荧光变化。
熔解曲线分析：荧光信号随温度升高而下降，取导数（-dF/dT）后得到Tm峰值。
软件计算与输出：赛默飞的软件可自动识别Tm峰值并输出精确数据。
四、实验准备与操作步骤
1. 试剂准备
qPCR Master Mix（含SYBR Green）
引物（Forward/Reverse）
模板DNA
无RNA酶水
2. 反应体系配置（以20 µL体系为例）
| 组分 | 体积（µL） |
|---|---|
| SYBR Green Mix | 10 |
| 上游引物（10 µM） | 0.8 |
| 下游引物（10 µM） | 0.8 |
| 模板DNA | 1 |
| 无RNA酶水 | 7.4 |
| 总计 | 20 |
3. PCR反应程序设定
初始变性：95℃，2分钟
循环步骤（40个循环）：
变性：95℃，15秒
退火/延伸：60℃，30秒
熔解曲线分析：
起始温度：60℃
终止温度：95℃
升温速率：0.3~1℃/s，持续监测荧光
4. 数据获取与Tm值分析
实时监测荧光并记录扩增曲线
启动熔解曲线模块，导出-dF/dT vs. T图形
Tm值对应曲线峰值所在温度
五、结果判读与质量控制
1. 熔解曲线解析
单一Tm峰：代表扩增产物高度特异，说明实验设计合理。
多重Tm峰：提示非特异扩增或引物二聚体存在，需优化引物或反应条件。
Tm值偏低或偏高：可能为GC含量异常或体系缓冲液浓度偏差。
2. 影响Tm值的因素
GC含量：GC对DNA稳定性贡献高，Tm值随GC比例升高而提高。
引物长度：短引物Tm低，建议设计长度为18~25 bp。
盐浓度：高离子强度能稳定双链DNA，提高Tm值。
DNA浓度：模板过多可能引起熔解曲线畸变。
染料浓度与兼容性：需选择适合仪器和应用的染料。
六、典型应用举例
1. 突变检测（如SNP分析）
通过引物或探针与目标序列结合后的Tm差异识别碱基突变。例如，某位点A→G突变可导致Tm值从78.5℃变为76.3℃。
2. 引物筛选
在多个候选引物中，通过测定Tm值及熔解曲线形态选出特异性强、产物纯净的引物组合。
3. 产物鉴定
针对扩增产物的Tm值进行比对，辅助确认扩增物是否为预期序列，尤其适用于无电泳分析条件下的高通量实验。
七、注意事项与实验优化建议
引物设计软件推荐使用Primer3、Oligo等，并确保Tm值相近（差值≤2℃）。
设定熔解曲线前应关闭扩增荧光，以避免干扰。
若发现Tm值波动较大，建议优化Mg²⁺浓度、PCR循环参数或更换试剂批次。
对多重PCR反应，Tm值分布应尽量错开，便于识别各目标产物。
八、结语
通过实时荧光定量PCR仪测定Tm值，实验人员可以获得关于扩增特异性、产物性质、突变识别等多方面的重要信息。赛默飞实时PCR平台配合高分辨率熔解曲线分析功能，使得Tm值测定更为精准、稳定。该技术在基因分型、病原检测、转基因筛查等场景中已得到广泛应用。合理利用这一工具，能够显著提高实验效率与数据质量。
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