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赛默飞荧光定量PCR仪操作指南:步骤、技巧与注意事项
2025-3-18 阅读(96)
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以下是赛默飞荧光定量PCR仪（以QuantStudio 5为例）的操作指南，包括详细步骤、实用技巧以及使用过程中的注意事项，旨在帮助用户规范使用流程，提升实验效率与数据准确性。
一、实验准备阶段
1. 仪器检查
打开设备电源，检查是否正常启动；
查看触摸屏界面是否响应灵敏；
确认仪器运行环境清洁，通风良好；
检查样品槽与加热盖是否干净、无异物。
2. 耗材准备
二、实验步骤
步骤一：反应体系配置
配置原则：
所有反应体系在冰上操作，避免酶失活；
设置阴性对照（NTC）和阳性对照，确保结果可靠。
常见反应体系（20μL）示例：
| 成分 | 体积（μL） |
|---|
| 2× Master Mix | 10 |
| 上游引物（10μM） | 0.8 |
| 下游引物（10μM） | 0.8 |
| 探针或染料 | 根据说明书 |
| 模板DNA/cDNA | 2 |
| 无核酸酶水 | 补足至20 |
步骤二：样本加载
使用多道移液器将反应体系均匀分装到PCR板中；
避免气泡产生，可轻轻离心板子消除气泡；
使用光学封板膜密封，确保密封性和光学透明性；
标记板子边角，便于后续在软件中定位样本孔。
步骤三：加载PCR板并设置程序
打开仪器上盖，将样品放入样品槽中；
合上上盖（带加热盖）；
在QuantStudio软件中：
mathematica复制代码初始变性：95°C，2分钟 PCR循环：95°C 15秒 → 60°C 1分钟，40个循环 （如需熔解曲线，添加最后一步）
点击“Start Run"启动实验。
三、实验后数据处理
1. 实时监控
实验过程中可实时查看荧光曲线；确认每个样本扩增是否符合预期（有无拖尾、迟滞、漂移等异常）。
2. 数据分析
四、实用技巧
| 项目 | 技巧建议 |
|---|
| 引物设计 | 优先使用已验证引物，避免二聚体或非特异性扩增；退火温度差控制在1~2°C |
| 多重反应 | 各探针染料避免荧光光谱重叠；使用不同通道分辨；优化反应条件防止竞争反应 |
| 模板质量 | RNA需高质量，避免降解；建议使用柱式提取、测OD260/280比值确认纯度 |
| 板子离心 | 装板后轻离心，去除气泡，避免光路干扰 |
| 实验重复 | 至少设置技术重复3次，确保统计意义 |
五、注意事项
操作方面
软件使用
正确设置每个孔的荧光染料通道和样本分组；
使用模板保存实验设置，减少重复录入；
实验结束及时保存原始文件以备追踪。
仪器维护
每月用无尘布或酒精棉清洁仪器表面；
避免将液体洒入仪器内部；
定期校准温控和光学模块（可联系厂家技术服务）。
六、小结
赛默飞QuantStudio 5荧光定量PCR仪凭借稳定的性能和便捷的操作，在各类分子生物实验中发挥了重要作用。通过规范的操作流程、优化的实验设置和细致的维护管理，用户可以获得准确、稳定、重复性良好的检测结果。掌握操作技巧和注意事项，不仅能提升实验效率，也有助于减少实验失败和数据偏差。对于长期开展qPCR实验的实验室，建立标准操作流程（SOP）尤为重要。
