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赛默飞荧光定量pcr仪使用方法
2024-12-25 阅读(225)
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赛默飞荧光定量PCR仪（如 QuantStudio 系列、ABI 7500 系列）广泛用于基因表达分析、病原体检测、基因分型等实验。以下是荧光定量PCR仪的标准操作方法，帮助您完成实验。
1. 仪器操作前的准备
实验设计
确定实验目标：
基因表达定量、病原体检测、SNP分析等。
选择合适的试剂体系：
使用 TaqMan 探针、SYBR Green 染料或其他符合实验需求的反应体系。
实验材料准备
样本模板（如 DNA、RNA 经过反转录的 cDNA）。
引物和探针（设计特异性高的引物和探针）。
PCR 反应试剂（如 Taq 酶、dNTPs）。
PCR 反应板（96孔或384孔，依仪器型号选择）或 PCR 管。
无菌操作工具（如移液器、滤芯吸头）。
检查仪器状态
确保荧光定量PCR仪已正确连接电源并开机。
检查仪器是否校准，包括光学通道和温控模块。
清洁样本托盘，避免污染。
2. 样本和反应混合物的制备
标准 PCR 反应体系（以 20 µL 反应体系为例）：
| 成分 | 体积（µL） | 说明 |
|---|---|---|
| 样本模板 | 1-2 | 根据实验需求调整浓度和体积 |
| 引物对（10 µM） | 0.4-1.0 | 每对引物（正向和反向） |
| 探针或染料 | 0.5 | 如 TaqMan 探针或 SYBR Green 染料 |
| PCR 反应缓冲液 | 10 | 含 Mg²⁺、dNTPs 等 |
| Taq DNA 聚合酶 | 0.5 | 热稳定酶，支持实时扩增 |
| 无核酸酶水 | 调至总量 20 µL | 确保反应体系最终体积正确 |
步骤：
在无菌环境下混合所有反应成分，轻轻振荡均匀，避免气泡产生。
将混合好的反应液分装至 96 孔 PCR 板或 0.2 mL PCR 管中。
在每个孔/管上覆盖光学透明封板或封膜，防止蒸发。
确保每孔的体积一致，以避免离心过程中不平衡。
3. 荧光定量PCR仪操作步骤
1. 启动仪器
按仪器型号启动，如 QuantStudio 系列或 ABI 7500 系列。
打开仪器配套软件（如 QuantStudio Design and Analysis 软件）。
2. 设置实验参数
选择实验类型：
绝对定量实验：检测样本中靶基因的绝对拷贝数。
相对定量实验：研究靶基因在不同样本中的表达水平。
溶解曲线分析：用于区分特异性扩增和非特异性扩增产物。
输入实验设计：
输入靶基因和对照基因的信息。
荧光染料/探针类型（如 FAM、SYBR Green）。
选择样本板格式：
根据实验需要选择 96 孔板或 384 孔板。
设置每个孔的样本名称、反应成分和靶标信息。
设置 PCR 程序：
初始变性： 95°C，2 分钟。
循环反应：
95°C，15 秒（变性）。
60°C，30-60 秒（退火和延伸），共 40-45 个循环。
标准热循环程序：
如果是溶解曲线分析，加入升温梯度（如从 60°C 升至 95°C）。
3. 加载样本板
将已封装好的 PCR 板或 PCR 管放入仪器样本托盘。
确保板的摆放位置正确，并关闭样本舱门。
4. 启动运行
点击软件中的 "运行" 按钮，启动实验程序。
仪器开始热循环过程，同时采集荧光信号。
4. 数据分析和结果处理
1. 实时监测
仪器运行期间，可实时观察荧光信号累积曲线，监控样本扩增状态。
2. 结果分析
扩增曲线：分析每个样本的荧光信号累积曲线，判断 Ct 值（循环阈值）。
Ct 值分析：
定量分析靶标的表达水平。
样本浓度越高，Ct 值越低。
溶解曲线（SYBR Green 实验）：判断扩增产物的特异性。
标准曲线分析（绝对定量实验）：根据标准品浓度绘制标准曲线，计算样本浓度。
3. 数据导出
实验完成后，通过软件导出实验数据（如扩增曲线图、Ct 值表）。
数据可保存为 Excel、PDF 或其他格式，方便后续分析。
5. 仪器清洁与维护
样本舱清洁：
每次实验后，用无尘布轻轻擦拭样本托盘，去除可能的污染物。
定期清洁光学模块（如说明书所示），确保荧光检测灵敏度。
软件维护：
定期更新仪器和软件至最新版本，获取最新功能和性能优化。
校准与检测：
定期校准仪器光学系统和温控模块，确保数据准确性。
如果仪器长期未使用，建议在正式实验前进行性能验证。
安全存储：
关闭仪器电源，保持设备干燥。
防止样本托盘接触过高湿度或灰尘。
注意事项
样本准备阶段：
严格避免交叉污染。
使用无 RNA 酶、无 DNA 酶的耗材。
模板样本浓度适中，过高会导致抑制扩增。
反应体系配置：
所有操作在冰上进行，防止酶降解。
确保所有反应组分混合均匀。
实验运行阶段：
不要随意中断仪器运行，避免影响实验数据。
保证实验室环境稳定，避免震动或电力波动。
总结
赛默飞荧光定量PCR仪的使用主要包括 样本准备、反应体系配置、仪器参数设置、运行程序以及数据分析 等五个核心环节。严格按照操作规范可以有效提高实验的成功率和数据的可靠性。实验完成后，定期维护仪器可确保其长期稳定运行。
