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杭州实了个验生物科技有限公司
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赛默飞实时荧光定量PCR的工作流程
2024-11-25 阅读(291)
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赛默飞实时荧光定量PCR仪（如ViiA™ 7、7500、QuantStudio系列）以其高精度和多功能性广泛应用于分子生物学实验。要实现高效、准确的实验结果，遵循标准化的工作流程至关重要。以下是赛默飞实时荧光定量PCR仪的详细工作流程，从样品准备到数据分析的每个环节均作了详尽说明。
1. 实验准备阶段
(1) 样品准备
核酸提取：
从细胞、组织或其他样品中提取目标DNA或RNA模板。
如果是RNA样本，需使用逆转录酶将RNA转录为cDNA。
确保核酸的纯度和浓度符合实验要求（如无抑制剂残留）。
样品定量与质量检测：
使用分光光度计或荧光计检测核酸浓度和纯度（260/280比值在1.8-2.0之间）。
通过电泳确认样品完整性。
(2) 配制PCR反应体系
选择试剂：
根据实验需求选择荧光染料法（如SYBR Green）或荧光探针法（如TaqMan探针）。
PCR反应混合液配制：
按以下配比准备PCR反应液（总反应体积10-50 μL）：模板DNA或cDNA（1-100 ng）；
引物（正向和反向，引物浓度一般为200-500 nM）；
荧光染料或探针（探针浓度一般为100-200 nM）；
dNTPs、Taq DNA聚合酶和缓冲液；
去离子水补足反应体积。
分装反应液：
将PCR反应液分装至96孔或384孔光学反应板中，每孔体积一致，避免气泡产生。
进行密封（使用光学透明薄膜或封板盖）并短时间离心，使反应液集中到底部。
(3) 仪器检查
检查仪器是否已正确连接到电源和电脑。
打开仪器软件，确保光学模块和温控模块运行正常。
检查反应板对齐是否正确，避免样品孔偏移影响荧光信号采集。
2. 实验运行阶段
(1) 加载反应板
打开仪器样品舱门，将密封好的反应板或试管架放置在托盘上。
确保反应板正确对齐，避免孔位偏移影响光学检测。
(2) 设置实验参数
在赛默飞软件（如QuantStudio或7500软件）中进行实验设置：
实验类型选择：
绝对定量：用于精确定量目标核酸。
相对定量：用于基因表达变化分析。
熔解曲线分析：检测扩增产物的特异性或突变分析。
根据实验目标选择适合的实验类型，如：
样品信息输入：
定义样品名称、分组信息和孔位分布。
设置目标基因和参考基因的信息。
荧光通道设置：
根据荧光探针或染料选择检测通道（如FAM、VIC、SYBR Green等）。
热循环程序设置：
常规PCR循环参数如下：变性：95℃，15秒；
退火/延伸：60℃，30秒；
初始变性：95℃，2分钟；
循环阶段（重复30-40次）：
熔解曲线分析（如适用）：从60℃升温至95℃，每0.5℃记录荧光信号。
(3) 启动实验
确认所有参数无误后，点击 “运行实验"。
仪器开始循环加热并实时采集荧光信号，生成扩增曲线。
3. 实验完成与数据分析阶段
(1) 检查实验完成状态
仪器完成实验后，软件会提示实验成功完成。
取出反应板并安全存放，以备后续验证或重复实验。
(2) 数据分析
查看扩增曲线：
检查扩增曲线是否呈现典型的S形曲线，确认扩增反应的有效性。
平稳的S形曲线表明扩增反应正常。
Ct值计算：
Ct值（Threshold Cycle）是荧光信号达到设定阈值的循环数。Ct值越小，说明模板起始量越高。
软件会自动计算每个样品的Ct值。
标准曲线分析（用于绝对定量）：
根据标准品的Ct值绘制标准曲线，计算未知样品的浓度。
相对定量分析：
比较目标基因与参考基因的表达水平，计算相对表达量（通常使用ΔΔCt法）。
熔解曲线分析（用于SYBR Green染料法）：
检查扩增产物的特异性。单一峰值表明扩增特异性良好；多峰值可能提示非特异性扩增或引物二聚体形成。
(3) 数据导出与保存
将实验数据保存为软件支持的文件格式（如 .eds 或 .xls），便于后续分析和报告撰写。
4. 仪器清理与维护
(1) 清理样品托盘
实验完成后，用无尘布清洁样品托盘，确保无残留液体或杂质。
(2) 光学模块清洁
每周用光学专用清洁液轻轻擦拭光学窗口，避免灰尘或指纹干扰荧光检测。
(3) 定期校准
每3-6个月校准一次温控模块和光学检测系统，确保仪器性能稳定。
5. 注意事项
样品制备：
确保核酸样品无污染，提取过程使用无RNase、无DNase的耗材。
模板浓度适中，避免过量或过稀导致非特异性扩增。
试剂配制：
使用新鲜的试剂，避免因试剂降解导致实验失败。
仪器环境：
将仪器放置在干燥、无振动的实验环境中，保持室内温度和湿度稳定。
操作规范：
密封反应板时，确保无气泡干扰光学检测。
运行实验时避免中途打开样品舱门。
总结
赛默飞实时荧光定量PCR仪的工作流程涵盖样品准备、仪器设置、实验运行和数据分析等多个环节。通过严格遵守标准操作流程和注意事项，用户可以充分利用仪器的高灵敏度和高精度特点，获得可靠的实验数据。同时，定期维护和校准仪器可以确保长期稳定的性能，为实验室研究提供强有力的技术支持。
