大鼠8-异前列腺素F2α （ELISA）试剂盒 返回列表页

实验条件的选择

在 ELISA 中，选择各种实验条件很重要，包括：

(1)固相载体的选择：许多物质都可以用作固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、纤维素等。可以是孔板、试管、珠子等形式，常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。无论是何种载体，使用前都可以进行筛选：包被等量的抗原，在相同的实验条件下进行反应。

(2)包被抗体(或抗原)的选择：当抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度较好，一般要求pH在9.0～9.6之间在吸附过程中。吸附温度、时间和蛋白质的量也有一定的影响，一般4℃18～24小时。蛋白质包被的最佳浓度需要进行滴定：即在包被不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg/ml等）后，在其他测试条件相同的情况下观察阳性样品的OD值.选择 OD 值最高、蛋白质含量最少的浓度。对于大多数蛋白质，通常为 1-10 μg/ml。

（3）酶标抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法滴定初始效价（见酶标抗体部分）。然后固定其他条件或采用“方阵法"（包被材料、待测样品对照品和酶标抗体处于不同稀释度）在正式实验系统中准确滴定工作浓度。

(4)酶底物和氢供体的选择：氢供体的选择要求便宜、安全、显色反应明显，但本身是无色的。一些供氢体（如OPD等）具有潜在的致癌作用，应予以保护。有条件的应选用非致癌、高灵敏度的供氢体，如TMB、ABTS等，都是比较满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱停止。一般底物作用时间为10-30分钟。底物溶液必须新鲜配制，特别是在使用前应立即加入 H2O2。

主要设备

试剂

(1) 包被缓冲液（pH9.60.05M 碳酸盐缓冲液）：

Na2CO3 1.59g

碳酸氢钠 2.93g

加入蒸馏水至 1000ml

（2）洗涤缓冲液（PH7.4PBS）：0.15M

KH2PO4 0.2g

Na2HPO4 12H2O 2.9g

氯化钠 8.0g

0.2g

Tween-20 0.05% 0.5ml

加入蒸馏水至 1000ml

(3) 稀释剂：

牛血清白蛋白 (BSA) 0.1 克

加入洗涤缓冲液至 100ml

或用山羊血清、兔血清等血清和洗涤液补足5-10%。

(4) 终止液（3M H2SO4）：

滴加蒸馏水178.3ml、浓硫酸（98%）21.7ml。

(5)底物缓冲液(PH5.0磷酸枣柠檬酸)：

0.2MNa2HPO4 (28.4g/L) 25.7ml

0.1M柠檬酸（19.2g/L）24.3ml

加入 50ml 蒸馏水。

(6)TMB(四甲基联苯胺)溶液：

TMB（10mg/5ml 无水乙醇）0.5ml

底物缓冲液 (PH5.5) 10ml

0.75%H2O2 32μl

(7) ABTS使用液：

ABTS 0.5mg

底物缓冲液 (PH5.5) 1ml

3%H2O2 2μl

(8)抗原、抗体和酶标抗体。

(9)正常人血清和阳性对照血清。

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