简介

获得高质量和完整的 RNA 是很多分子生物学实验中最重要的一步，当前应用最多的是 Trizol/氯仿萃取的方法。

原理

1、４℃ 预冷离心机;

2、取出培养皿，在超净台中去除培养基，按照每 1x107 细胞加入 １ｍL Trizol 试剂，用枪头吹打充分裂解细胞;

3、将细胞裂解液转移到 1.5 mL 无 RNA 酶的 EP 管中，向每个 EP 管中加入（1/5 Trizol 体积的）200 μL 氯仿，上下翻转充分混合后，室温静置 10 分钟，使核酸蛋白复合物wan全解离;

4、在 ４℃ 下 12000 g 离心 15 分钟;

5、离心后，将上层水相（约 1/2 Trizol体积）小心转移到一个新的 EP 管，加入等体积异丙醇，震荡后室温静置 5-10 分钟，然后 12000 g 4℃ 离心 15 分钟，弃上清保留沉淀;

6、加入1 mL 75％ 乙醇清洗并沉淀 RNA，12000 g 离心 10 分钟;

7、弃上清，并重复上述操作一次;

8、弃上清，在超净工作台中打开 EP 管盖，风干 5-10 分钟，不需wan全干燥;

9、视沉淀的量，加入 10-30 μL RNase-Free 的 DEPC 双蒸水中;

10、待沉淀溶解后，用 nanodrop 测定其浓度和纯度并作标记，进行下游实验，多余的RNA 保存于 -80℃ 冰箱。

用途

RT-PCR、分子克隆、Northern-Blot、RNA 体外转录与翻译等。

材料与仪器

【材料】：细胞；Trizol 试剂；氯仿；异丙醇；75％ 乙醇（使用 RNase-Free 水配制）；RNase-Free 水。

【物品及仪器】：1.5 ml EP管（RNA-free），大，中，小号枪头（RNA-free），移液器，涡旋振荡器，高速冷冻离心机，超净工作台。

步骤

1、４℃ 预冷离心机;

2、取出培养皿，在超净台中去除培养基，按照每 1x107 细胞加入 １ｍL Trizol 试剂，用枪头吹打充分裂解细胞;

3、将细胞裂解液转移到 1.5 mL 无 RNA 酶的 EP 管中，向每个 EP 管中加入（1/5 Trizol 体积的）200 μL 氯仿，上下翻转充分混合后，室温静置 10 分钟，使核酸蛋白复合物wan全解离;

4、在 ４℃ 下 12000 g 离心 15 分钟;

5、离心后，将上层水相（约 1/2 Trizol体积）小心转移到一个新的 EP 管，加入等体积异丙醇，震荡后室温静置 5-10 分钟，然后 12000 g 4℃ 离心 15 分钟，弃上清保留沉淀;

6、加入1 mL 75％ 乙醇清洗并沉淀 RNA，12000 g 离心 10 分钟;

7、弃上清，并重复上述操作一次;

8、弃上清，在超净工作台中打开 EP 管盖，风干 5-10 分钟，不需wan全干燥;

9、视沉淀的量，加入 10-30 μL RNase-Free 的 DEPC 双蒸水中;

10、待沉淀溶解后，用 nanodrop 测定其浓度和纯度并作标记，进行下游实验，多余的RNA 保存于 -80℃ 冰箱。

注意事项

1、过程中需佩戴口罩和新手套，对台面以及周围环境进行灭酶处理，尽量在超净台中进行操作；

2、使用无 Rnase 的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

3、溶液配制应使用无 Rnase 的水，（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入 DEPC 至终浓度为 0.1%（V/V)，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC 有致癌之嫌，须小心操作）。

4、Trizol 裂解液非常危险，因小心避免溅到身上，台面上的 Trizol 要及时清理干净。

常见问题

RNA 得率过低：

1.使用更有效的破碎/匀浆方法。如液氮捣碎、酶消化破壁、电动匀浆器匀浆；

2.更换抽提试剂；

3.核酸浓度低时，采用低温沉淀，并延长沉淀时间；

4.增加细胞。

RNA 质量不高：

1、取上层水相时求多，吸到了下层有机相；

2、清洗不干净。

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