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| 供货周期 | 现货 | 规格 | 50T |
|---|---|---|---|
| 货号 | YLK10374P | 应用领域 | 化工,生物产业 |
| 主要用途 | 科研实验 | 英文名称 | Viral Nervous Necrosis Virus(VNNV) SYBR qRT-PCR |
| 保存条件 | 低温运输，-20℃保存 | 有效期 | 12个月 |
| 试剂盒说明 | 不同批号的试剂盒组分不可交互使用 |
病毒性神经坏死病病毒染料法RT-PCR试剂盒
商品名称：病毒性神经坏死病病毒染料法RT-PCR试剂盒
Name ：Viral Nervous Necrosis Virus(VNNV) SYBR qRT-PCR Kit
病毒性神经坏死病病毒(Viral Nervous Necrosis Virus，VNNV)是一种RNA病毒，会引起病毒性神经坏死病，流行于除美洲和非洲外几乎世界所有地区的海水鱼类，对仔鱼和幼鱼危害很大，严重者在一周内死亡率可达100%，且近年受感染的鱼类种类和受危害程度迅速增加，带来重大经济损失，因此快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本产品基于PCR原理开发。它具有下列特点：
1. 一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2. 根据病毒性神经坏死病病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
3. 基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。
4. 使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5. 本产品足够50次30μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。
【试剂组成】
成 份 | 十孔盒包装 |
2×qRT-PCR 缓冲液 | 500 μL（棕色管） |
10×qRT-PCR酶混合液 | 100 μL（红盖） |
ROX染料I | 50 μL（棕色管） |
ROX染料II | 50 μL（棕色管） |
荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL（亮黄盖） |
病毒性神经坏死病病毒RT-PCR引物混合液 | 100 μL（白盖） |
病毒性神经坏死病病毒RT-PCR阳性对照 （1×10E8拷贝/μL） | 50 μL（黄盖） |
核酸释放剂试用装 | 20次（1mL，绿盖） |
使用手册 | 1份 |
【储存条件及有效期】
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供RNA片段作为阳性对照。
【自备试剂】样品RNA
【使用方法】
一、稀释阳性对照（以10E2-10E7这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入45 μL 荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
2. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
3. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
4. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品RNA的制备
5. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号（浓度为1×10E4拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。
6. 用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。
三、设置RT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，
7. 1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号阳性对照稀释液做模板）。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。
8. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：
成分 | N+2个制备所得样品 | RT-PCR阴性对照 | RT-PCR阳性 对照（2-7管） |
2×qRT-PCR 缓冲液 | 10μL | 10μL | 各10μL |
口蹄疫病毒RT-PCR 引物混合物 | 2μL | 2μL | 各2μL |
50×ROX (见注) | 0.4μL | 0.4μL | 各0.4μL |
样品制备所得RNA模板（来于第8步） | 5.6μL | 不加 | 不加 |
稀释所得6个阳性对照（来于第6步） | 不加 | 不加 | 各5.6μL（2号样到2号管，3号样到3号管…） |
10×qRT-PCR 酶混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |
注:需使用ROX染料I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。需使用ROX染料II的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。
9. 上机后按下面参数进行RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。
过程 | 温度 | 时间 |
RT（逆转录） | 50℃ | 15-30分钟 |
预变性 | 94℃ | 2分钟 |
RT - PCR反应 （30个循环） | 95℃ | 15 秒 |
60℃ | 15 秒（采集FAM通道的荧光信号） | |
72℃ | 15 秒 | |
按仪器预设程序进行溶解曲线分析 | ||
四、数据处理
10. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
11. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
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