禽腺病毒(FADV)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)

通用名称：禽腺病毒(FADV)核酸检测试剂盒(荧光PCR法) 

Name ：Fowl Adenovirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】25T/盒、50T/盒

【预期用途】

禽腺病毒(Fowl Adenovirus, FADV)是无囊膜、线性双股 DNA 病毒,属于腺病毒科、禽腺病毒属成员。该病毒可感染鸡、火鸡及其他禽类。FADV 可致鸡发生包涵体肝炎、心包积水综合征和肌胃糜烂等疾病。该病常与禽类其他病原混合感染,感染鸡只可继发再生障碍性贫血、肝炎及产蛋量下降等。FADV 呈世界性分布,病毒可经粪-口途径水平传播,也可垂直传播,给养禽业造成巨大经济损失。

本试剂盒适用于检测呼吸道分泌物棉拭子（感染 I 群禽腺病毒的鸡、火鸡、鹅、鹌鹑）、卵巢、输卵管、卵泡、子宫和输卵管粘膜组织、泄殖腔拭子（感染 II、III 群禽腺病毒的鸡、鸭）等样本中的禽腺病毒，用于禽腺病毒感染的辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对禽腺病毒特异性引物，结合一条特异性探针[1]， 用荧光 PCR 技术对禽腺病毒的核酸进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死禽取卵巢、输卵管、卵泡、子宫和输卵管粘膜组织；活鸡取呼吸道拭子或泄殖腔拭子，放于 1mL 50%

甘油生理盐水中

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1.  样品处理（样本处理区）

1.1 样本前处理

组织样品：称取样品约 1g，手术/剪剪碎混匀后，于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中；泄殖腔拭子直接取 100μL 提取

1.2  核酸提取

推荐采用公司生产的核酸提取/或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请    按照试剂说明书进行操作。

2.  试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

3.  加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀， 短暂离心。

4.  PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1  将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2  设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，请勿选择 ROX 参比荧光。

4.3  推荐循环参数设置：

5.  结果分析判定

5.1  结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2  结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；

可疑：检测通道 35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38，且曲线有明显的增长曲线， 判定为阳性，否则为阴性；

阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

6.  质控标准

阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7.  检测方法的局限性

1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3. 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4. 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5. 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6. 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7. 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1. 所有操作严格按照说明书进行；

2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化，wan全混匀并短暂离心；

3. 反应液应避光保存；

4. 反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1]文艳玲, 禽腺病毒 hexon 基因克隆表达及间接 ELISA 和荧光 PCR 检测方法的建立[J]. 广西大学, 2008.