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细胞传代培养

根据细胞生长的恃点，细胞传代培养方法有3种：贴壁生长细胞传代、半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）、悬浮生长细胞传代。

◆ 贴壁生长的细胞用消化法传代；

◆ 部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代；

◆ 悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。

实验材料：细胞、D-Hanks液、胎牛血清、DMEM培养基 / RPMI1640培养基、Penicillin-Streptomycin（P/S双抗）、胰蛋白酶

仪器与耗材：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱、倒置相差显微镜、培养箱、玻璃瓶、细胞培养瓶/皿、废液缸、离心管、红血球计数板、不同规格的移液器及其配套的无菌吸头、吸管

1.  贴壁细胞的消化法传代：

1）先吸除或倒掉瓶内旧培养液。

2）D-Hanks液洗2～3次。

3）向瓶内加入适量消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。（注意：胰蛋白酶要预温，温度37℃左右为宜。）

4）消化最好在37℃环境下进行，消化2～5 min 后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即终止消化。

5）吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉，再添加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液，终止消化。

6）用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞。从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，不要用力过猛。 

7） 细胞计数后分别接种在新的培养瓶内。

8）置于37℃细胞培养箱培养。（注意：要定时观察细胞，如发现污染，应及时处理。）

2.  悬浮细胞的传代：悬浮细胞传代可离心收集细胞后传代，或直接传代。

离心传代法：

1） 将细胞连同培养液一并转移到15 ml 离心管内。

2） 800~1000 rpm离心5 min。（注意：离心转速要合适。转速过低，不能有效分离细胞；离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。）

3） 弃去上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液。

4） 计数，分别接种在新的培养瓶内。

 直接传代法：

让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉1/2~2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。

3.  部分贴壁细胞的传代

1）部分贴壁不牢的细胞，如Hela细胞等，不经消化处理直接吹打可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。
2）对绝大部分贴壁生长的细胞，因直接吹打对细胞损伤较大，细胞常有较大数量的丢失，因而需消化后，才能吹打传代。